DNA定量检测方法研究进展概况

刘 霞，石会龙

(中国石油大学胜利学院 化学工程学院，山东 东营 257100)

作为一类生物大分子，脱氧核糖核酸(DNA)不仅是遗传信息的载体，而且能够影响生命机能和生物体发育。每条DNA链由两条DNA单链构成，两条DNA单链连接构成双螺旋结构。此外，每条DNA单链上都分布着碱基，构成DNA双链上的两条DNA单链上的碱基按照碱基互补配对原则进行排布。

DNA不但对生命体正常的生长繁殖和发育等生命活动具有十分重要的作用，而且与生命的异常情况，包括肿瘤发生、放射损伤、遗传疾病也有密切关系。DNA定量检测在生物工程、药理学、临床诊断中有重要的作用。例如，乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)已成为了近年来研究的热点之一。通过对HBV DNA进行定量检测可以得知肝炎患者的病毒血症水平，准确反映机体的病毒感染情况，从而弥补了定性检测的不足。在此基础上，病毒血症水平可以提供抗病毒治疗的依据及判断其疗效[1]。因此，对DNA定量分析方法展开研究具有重大意义。

1 DNA定量检测的传统方法

DNA的定量检测有很多种方法。早期的DNA定量检测方法主要包括紫外吸收法、定磷法、定糖法等。

在早期的DNA定量检测方法中，紫外吸收法原理简单，操作方便，应用非常广泛。紫外吸收法的基本原理是：DNA在260 nm附近有最大吸收。据此，可以通过紫外吸收法对DNA进行定量、定性测定。紫外吸收法具有简单快速等特点，但是由于DNA的摩尔吸光系数仅103数量级，灵敏度较低，因此不适合检测微量或痕量的DNA片段。

除紫外吸收法之外，定磷法和定糖法在早期也被广泛应用于DNA的检测。定磷法的主要原理：由于磷酸基团是核酸链的主要组成单元之一，且纯的核酸中磷元素的含量较高，约为9.5%，所以可以通过测定磷元素的量来测定核酸含量。该方法反应灵敏，适合检测含量为10～100 μg/mL。与磷酸基团一样，脱氧核糖同样是DNA链的重要组成部分，而且具有特殊的显色反应，因此可以根据定糖法进行核酸的定量检测。二苯胺法测定核酸方法就是以此为基础的，这是一种较为古老且至今仍常用的一种方法。其基本原理为：在强酸性条件下，DNA发生水解反应，水解后的DNA能与二苯胺反应，生成蓝色产物，在波长为600 nm处有最大吸收峰，由此可以测得DNA的含量。该种方法准确、灵敏度高，但是反应周期冗长，约为16～20 h[2-3]。

以上方法均为DNA定量检测的方法，检测方法较为准确。但是其灵敏度普遍较低，只能达到10～400 μg/mL，不足够用于微量或痕量DNA的定量检测。而且，以上检测方法检测到的DNA浓度是指样品中所有的DNA的浓度，并不能针对某一种特定的DNA序列进行检测。但是近年来，由于癌症等疾病的出现都与DNA片段的突变等联系密切，因此检测微量特定序列的DNA的方法对于疾病诊断、临床医学来说非常有用。检测某种特定序列的微量DNA变得意义重大，这一领域的研究也得到迅速的关注与发展。

2 特定序列的微量DNA的定量检测方法

近年来，随着分析化学水平的发展，涌现出很多关于特定序列微量DNA的检测的方法，例如聚合酶链式反应(Polymer chain reaction,PCR)、DNA杂交技术(Hybridization chain reaction,HCR)等。对于DNA浓度的获得通常是通过荧光强度、紫外强度或者电化学信号进行表征。此外，在很多研究中，还利用了磁球技术、DNA探针标记物等方法将检测信号进一步放大进行。以上的一种方法或几种方法的结合大大降低了DNA定量检测的浓度下限，提高了检测的灵敏度和准确度。

2.1 PCR技术定量检测微量DNA

近年来， PCR技术发展迅速，被广泛应用于生物医学检测领域。DNA 的天然复制过程以半保留复制的方式进行。PCR技术的原理与DNA天然复制的过程类似，它的特异性依赖于位于目标序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR的基本反应步骤包括三步，即变性、退火、延伸。重复循环变.性、退火、延.伸三个过.程就可增加“半保.留复制链”的数量，而且形成的这种新.链又可以成为下次循.环的模板。每完成一个循环大约需2～4 min，经过2～3 h就能实现将待复制的DNA片段数量扩增放大几百万倍，这使得DNA检测的检测限得到很大程度的降低，使检测的灵敏度得到了提高。

张艳奇通过PCR技术对乙肝患者乙肝病毒(HBV-DNA)进行了检测。通过对327例乙肝患者样品的检测，阳性检出率为96.43%，对疾病的早期治疗具有指导意义[4]。

利用PCR技术检测DNA有很多优点：灵敏度高、特异性高、简便、快速、纯度要求低。但是PCR技术的过程依赖于温度的变化和精密的仪器，所以利用PCR技术检测DNA的方法过程比较复杂，并且成本较高，耗时长[5-6]。

2.2 利用DNA杂交反应(HCR)技术定量检测微量DNA

碱基互补配对原则是HCR技术的基础。已知待检测目标DNA的分子的碱基序列，我们可以设计部分碱基序列与之互补的用DNA探针，使探针DNA分子与目标DNA分子按照碱基互补配对原则进行杂交，形成DNA双链片段。DNA杂交技术是DNA检测研究中最常用和最基本的检测方法之一，因此，围绕该技术的新方法研究一直是人们感兴趣的领域。

2.2.1 利用纳米颗粒及磁性粒子等与HCR技术结合进行微量DNA定量检测

朱金坤等人通过磁性粒子对DNA实现了化学发光信号的表征检测。首先，他们将DNA1标记的CuS纳米颗粒、目标DNA、DNA2标记的磁性粒子混合，通过DNA1、目标DNA、DNA2之间的杂交反应，使三者结合在一起。然后将通过磁性粒子的富集，实现其浓度的增大。将CuS颗粒溶解释放，对其化学发光信号进行检测，就可以实现对目标DNA浓度的表征。通过此种方法获得的DNA浓度检测限为3.0×10-12mol/L，并且在1.0×10-11～ 1.6×10-9mol/L范围内具有线性关系[7]。

沈丽萍等使用链霉亲和素涂覆的磁性纳米微球作为Ru(bpy)32+-NHS的载体对微量DNA进行电化学发光检测。在外加磁场的固定下，磁性微球能较好地固定在工作电极上，而且未反应到磁球上Ru(bpy)32+-NHS也可以在磁场的固定下很容易地清洗掉，从而保证电化学发光检测的结果，不受到杂质的影响[8]。

朱进清等发展了一种基于“树枝状”信号放大的电化学生物传感器用于微量DNA的定量检测。在本项研究中，他们巯基修饰的DNA1作为捕捉探针固定到金电极表面，然后通过捕捉探针DNA1与目标分子的杂交进一步将目标DNA分子固定。将巯基修饰的探针DNA2固定到金纳米颗粒的表面，金纳米颗粒为球形结构，表面可以修饰多条DNA2分子。通过DNA2分子与目标分子之间的杂交，形成了第一个“三明治”结构。同理，cDNA分子加入，使之与DNA2分子杂交，随后加入DNA1修饰的金纳米颗粒，使DNA1与cDNA进行杂交，形成第二个“三明治”结构。然后加入钌胺分子，钌胺分子通过静电作用会大量吸附在DNA分子上。最后通过计时电量法采集钌胺分子的电化学信号。通过两次形成“三明治”结构，对检测信号实行了两次放大。通过此方法，DNA的检测限被降低到了0.13 pmol/L[9]。

2.2.2 利用酶与HCR技术结合进行微量DNA的定量检测

由于酶的催化特异性、高效性和反应条件温和的特点，酶被广泛应用于DNA的定量检测中。在这些方法中，酶分子一般作为标记物，通过探针DNA或者检测DNA等与目标DNA进行定量的结合，然后催化相应的酶的底物，产生可以检测信号的产物。在这个过程中，产物信号的强弱取决于酶的数量。由于酶的数量与目标DNA分子的数量之间存在对应的数量关系，产物信号与目标DNA分子之间也存在着定量的关系。因此，通过这种方法可以实现对目标DNA的定量检测[10]。在酶放大技术检测DNA的方法中最常用酶的种类一般为辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。辣根过氧化物酶含有血红素，能利用H2O2氧化许多有机及无机化合物，并使底物发生颜色反应。而碱性磷酸酶( AP) 具有分子量小、稳定性好、活性高、易分离提纯等优点。并且与辣根过氧化物酶相比，其在缓冲液中可以直接催化底物发生反应，反应过程更简单、易于操作。碱性磷酸酶放大技术已广泛应用于微量DNA的检测。

张晓丽等人设计了一种方法，将捕捉DNA1固定到基板上，然通过捕捉DNA与目标DNA之间的杂交反应，将目标DNA固定。将捕捉DNA2修饰到磁性微球的表面，由于磁性微球的球形结构，一个磁性微球表面对用多条DNA2分子，通过DNA2分子与目标DNA分子之间的杂交反应，形成“三明治”夹心结构。在此结构中，一条目标DNA分子对应一个磁性微球。然后通过DNA2分子与目标DNA分子之间的去杂交反应，将磁性微球释放收集起来。将碱性磷酸酶标记的探针DNA3分子加入收集的磁性微球中，通过DNA2分子和DNA3分子之间的杂交反应，将大量的碱性磷酸酶固定到磁球上。利用磁球的磁性对磁球进行清洗、富集。将得到的酶标磁球与其催化底物磷酸二苯酯二钠陆续加入毛细管。在碱性磷酸酶的催化下，磷酸苯酯二钠被转化为苯酚。在毛细管的出口对苯酚进行电化学信号检测。磁球表面富集大量的碱性磷酸酶，因此每一个磁球会对应一个苯酚的曲线峰。因此，可以表征目标DNA的数量，进而得到其浓度。在此方法得到的DNA浓度检测的线性范围为5.0 × 10-16～ 1.0 × 10-13mol/L[11]。

除了利用酶的催化性能，对检测信号进行二次放大之外，DNA内切酶及外切酶也被广泛应用到了微量DNA的定量检测研究领域。

郭秋平等设计了一种发夹型的DNA探针。当不存在目标DNA时，荧光染料可以嵌入该探针茎部，发出很强的荧光信号。加入目标DNA后，目标DNA与探针DNA进行杂交，加入外切酶，从杂交产物的3'端水解探针DNA，释放目标DNA。同时，荧光染料也被释放，荧光强度降低。通过对荧光强度变化的表征，实现了对目标DNA浓度的检测。该种方法的检测限为320 fmol/L[12]。

3 结论与展望

纵观DNA定量检测的研究发展过程，我们发现DNA的定量检测方法近几十年来发展迅速，已经成为了研究的热门领域。检测方法由最开始的紫外分光光度计法、定磷法、定糖法等初级的检测手段，已经向着PCR技术、HCR技术为基础的更先进的研究方向进行。特别的HCR技术，由于不需要特定的仪器和复杂的控温过程等，近年来更是得到了相当大程度的发展。在HCR技术的应用中，通过DNA分子的杂交形成“三明治”结构更是与磁球放大技术、酶放大技术等可以进行灵活结合，对电化学信号、光学信号等检测信号进行放大或者二次放大，极大的降低了DNA浓度的检测限，并且普遍获得了较理想的线性范围，推动了微量DNA定量检测方法的发展。在未来，基于HCR技术的DNA定量检测方法仍然有很多发展的空间和可能性，一定会在分析化学领域、医学检测领域得到更广泛的推广和应用。