铜绿假单胞菌生物膜形成和发育分子机制研究进展

冯礼尚

（河南科技大学 食品与生物工程学院，河南洛阳 471023）

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）也称绿脓杆菌，是一种革兰氏阴性好氧的条件致病菌，在自然界广泛分布，体弱多病免疫力低下的人群以及伤口易感染此菌，PA还是医院内感染的主要病原菌之一。该菌极易形成生物膜（biofilms，BF），使其具有很强的适应不良环境的能力，它的感染性、致病性、耐药性以及对宿主免疫的抵抗性都与生物膜的形成有关[1-4]。本文根据近五年来国内外关于铜绿假单胞菌生物膜（PA-BF）形成和发育分子机制的研究进展，从PA-BF结构的分子组成、形成和发育的分子机制、基因的转移和调控三方面作以综述。

1 铜绿假单胞菌生物膜结构的分子组成及其作用

生物膜（Biofilms，BF），也称生物被膜或菌膜（Pellicle），是由细菌等微生物在人体和动植物体等表面黏附生长，并被自分泌的胞外多聚物基质（extracellular polymeric substances，EPS）包裹所形成的有组织、系统化的微生物群落，呈现膜状的形态结构，属于微生态系统范畴。生物膜中具有纵横交错的水管系统，用于吸收和运输营养物质并排泄废物，生物膜中的水分占90%以上。EPS包括胞外多糖（Exopolysaccharides）、胞外DNA（Extracellular DNA，eDNA）、蛋白质以及鞭毛（Flagellum）、菌毛（Pili）等细菌附属物[5-6]。

1.1 胞外多糖

与PA-BF形成有关的胞外多糖主要是Psl、Pel和藻酸盐多糖。Psl多糖由psl（polysaccharide synthesis locus）基因座编码的一族酶合成。psl基因座含有15个基因（psl A～O），组成一个操纵子。Psl多糖由D-甘露糖、D-葡萄糖和L-鼠李糖构成的五糖单元重复形成，在PA-BF形成的初期使菌体黏附定植在载体表面并维持BF结构的稳定。Pel多糖合成酶系由7个pel基因组成的操纵子转录产生，Pel多糖有利于PA在气-液交界面形成菌膜，对生物膜的结构具有支持和保护作用。藻酸盐（alginate）的结构由D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸组成的二聚体单元重复形成，具有黏附性，其大量表达增加生物膜细菌的耐药性和抗宿主免疫攻击能力。藻酸盐合成和分解有关的基因定性的确定了二三十个，其中algA、algC、algD参与GDP-甘露糖醛酸（藻酸盐前体）的合成；algG基因编码C5-甘露糖醛酸异构酶并防止藻酸盐的降解；algD基因编码GDP-甘露糖脱氢酶。基因mucA～D抑制藻酸盐合成[7-9]。

1.2 胞外DNA

胞外DNA（eDNA）是许多微生物生物膜中将菌细胞联结为整体的主要基质。PA-BF含有大量的eDNA，对于BF的形成和形态结构的维持具有重要作用。eDNA来源于PA-BF中衰老死亡菌细胞的裂解，或是QS诱导部分菌体释放的DNA[10]。在PA-BF形成的早期，eDNA作为菌体与载体表面或菌体之间的黏附剂而促进BF的形成；eDNA对于成熟期的BF具有稳定作用；在BF生长期，细菌处于感受态，大量释放出的eDNA为基因在菌体之间转移和交换提供了遗传素材，提高了BF菌群的基因转化率和遗传多样性[11]。

1.3 生物膜黏蛋白

凝集素（Lectin）是一类能与糖单元结合的蛋白质，在细胞识别和黏附反应中起重要作用。PA中与岩藻糖（Fucose）特异结合的凝集素lecA和lecB能在不同的菌细胞之间或菌体与胞外基质之间形成联结。PA还分泌大分子量的黏附蛋白（Adhesins），如LapA和LapF，能牢固地将菌细胞黏结在一起，有利于BF结构的稳定和抵抗不良的环境因素。

1.4 细菌细胞附属物——鞭毛和菌毛

PA鞭毛（Flagella）介导的菌体运动和黏附作用有利于菌体的迁移和微菌落的形成。菌毛（Pili）也叫纤毛（Fimbriae），由菌毛蛋白（Pilin）构成，包括普通菌毛和性菌毛，这两种菌毛都具有黏附和促进菌体移动的作用，但性菌毛数量较少，能介导质粒等遗传物质在细菌之间的转移。IV型菌毛在PA-BF形成中具有重要作用。PA合成的Cup纤毛，在BF形成的初期和成熟期有利于菌体之间发生交联。

2 铜绿假单胞菌生物膜形成和发育的分子调控机理

2.1 PA-BF形成和发育的显微过程

PA-BF的形成和发育可分为5个阶段。（1）菌体与载体表面的附着，其中鞭毛和菌毛介导迁移和黏附，胞璧多糖作为黏附配体。（2）黏附期（Attachment）：菌细胞分泌胞外基质产生不可逆的黏附，并能黏联其他的细菌着附。（3）形成微菌落：菌细胞定植后繁殖或黏附其他菌细胞形成微群落。（4）生物膜发育成熟：BF生长增厚，面积加大，形成完整的自给自供的微生态系统。（5）生物膜的分解与散播：随着BF的生长和加厚，会给BF内细菌带来不利影响，如营养缺乏、氧耗竭、一氧化氮等代谢废物积累、群体密度加大等，这些因素将诱导BF的分解和播散[12-13]。

2.2 群体密度感应系统对BF形成和发育的调控机制

群体密度感应系统（Quorum sensing system，QS）是指细菌间通过分泌化学信号分子调控特定基因表达与群体行为的一种生态生理机制。根据细菌合成的信号分子和感应机制不同，QS分为3种类型。（1）G-菌（革兰阴性细菌）的LuxI/R系统，利用酰基高丝氨酸内酯（Acylhomoserine lactone，AHL）类分子作为信号分子，LuxI是合成AHL类信号分子的酶，LuxR是能与AHL类分子结合并被激活的基因转录调控因子。LuxR能够识别基因启动子区域的luxbox序列。（2）G+菌利用寡肽（oligopeptide）作为信号分子，寡肽信号分子与细菌细胞膜上特异受体结合后激活细胞膜上的组氨酸蛋白激酶，使激酶的组氨酸残基磷酸化，进而激活靶基因的表达。（3）第三类密度感应系统结合了前二者的特点，用AHL类分子作为信号分子，其信号传导则采用了磷酸化-去磷酸化的双因子调控系统调控蛋白酶的活性与基因表达。PA有las、rhl与pqs三套相互关联的QS。las和rhl属于LuxI/R系统，分别以长链12碳酰基高丝氨酸内酯（HO-3-C12-HSL）和短链的4碳酰基高丝氨酸内酯（C4-HSL）作为信号分子，其受体蛋白分别是LasR和RhlR[14]。pqs系统利用喹诺酮类作为信号分子，受体蛋白是PqsR。Las系统正向调节rhl和pqs系统的基因表达。生物膜内细菌群体的密度足够高时，激活QS系统并调控BF形成和分解有关的基因表达[15]。pqs系统直接控制着eDNA的释放，eDNA介导BF可运动性PA与非运动性PA的相互作用，促进蘑菇状微菌落的形成。在PA-BF形成的早期，las系统的AHL信号分子激活菌体内降解c-di-GMP的酶系促进Psl多糖而抑制Pel的合成。QS还调节浮游细菌的表面运动能力与细菌的群体运动，进而影响BF的形成与分解。rhl系统调控鼠李糖脂（Rhamnolipid）的合成，实验研究表明，PA分泌的鼠李糖脂能使该菌在半固体表面产生涌动，促进微菌落的形成[16]。干扰和淬灭QS信号分子是控制细菌BF形成的重要策略，具体方法是合成或筛选QS信号分子类似物，干扰QS信息传递[17-20]，或者设计降解QS信号分子的酶。

2.3 第二信使c-di-GMP系统对PA-BF形成和发育的调控

G-菌的第二信使c-di-GMP（环鸟苷二磷酸）系统是其生理活动的调控中心，c-di-GMP在基因的转录、翻译以及翻译后等多j个水平调控基因表达[21]。c-di-GMP由鸟苷二磷酸环化酶（Diguanylate cyclase，DGC）催化两分子GTP合成，可被磷酸二酯酶（Phosphodiesterase，PDE）分解为没有活性的pGpG。DGC含有GGDEF活性结构域，而PDE具有EAL或HDGYP结构域。许多G-菌的蛋白质具有GGDEF或/和EAL结构域，组成了GGDEF/EAL蛋白超家族。但是G+菌的蛋白质不含或很少有GGDEF/EAL结构域，不能利用c-di-GMP调控其基因活动。PA的c-di-GMP水平与多糖合成基因转录活性及BF形成呈正相关，高水平c-di-GMP促进Pel多糖、藻酸盐的合成及BF形成，反之则增强细菌的运动和毒素的表达，抑制BF形成或促进其分解。菌体内的c-di-GMP水平还决定细菌从浮游生活向BF生存方式的转变。

c-di-GMP系统调控PA-BF形成和发育的分子机制：c-di-GMP通过与受体蛋白酶或转录因子的结合而调控BF多糖合成有关酶或基因的活性。c-di-GMP与蛋白酶Alg44结合促进藻酸盐合成，与蛋白酶PelD结合激活Pel的合成，与转录因子FleQ结合激活Pel基因操纵子的表达。FleQ是一个多效转录调节子，还能激活鞭毛蛋白合成基因的转录，可见c-di-GMP在菌体的运动与BF的形成中具有协调作用。

菌细胞内c-di-GMP水平的调控：菌细胞内c-di-GMP浓度是由一系列含有GGDEF/EAL结构域的对环境因素敏感的蛋白质调控，其表达水平与活性控制着c-di-GMP的水平。WSP（Wrinkly spreader phenotype）系统由WspA～F和WspR等7个蛋白组成，分布在菌细胞膜上，组成了级联感应系统。这一感应系统所感应的信息最终传递到双组分响应调节子WspR，该蛋白的磷酸化将激活DGC活性并合成c-di-GMP，促进胞外多糖合成。SadC是一种有DGC活性的膜蛋白，通过合成c-di-GMP促进胞外Pel多糖的合成及BF形成，抑制菌体的Swarming运动。酶蛋白BifA具有PDE活性，降解c-di-GMP，增强菌体的Swarming运动而抑制BF形成或有利于其分解和散播。

2.4 sRNA调节系统

PA-BF的形成和发育还受非编码小RNA（sRNA）等机制的调节。sRNA是一类长度在50～500个核苷酸，不能编码蛋白质，广泛存在于细菌中的RNA，调控多个生理过程。徐凤琴等研究了PA中sRNA系列的phrs，证明其在PA-BF形成中发挥重要调控作用。

3 生物膜内细菌基因的转移和重组及其对生物膜发育的影响

基因的水平转移可在同种或不同菌种之间进行，能使细菌在短时间内产生新的基因型个体，适应环境的变化或产生广泛的耐药性。生物膜内菌群密度大，细菌间基因的水平转移非常活跃，基因交换和重组的频率很高。基因的水平转移方式有转化、接合、转导等。（1）转化（Transformation）是在亲缘关系较近的细菌DNA之间进行的同源重组。BF菌群释放和摄入DNA的频率显著，DNA的转化率极大提高，促进了BF菌群遗传异质性和生物多样性的形成。（2）通过接合（Conjugation）形成的基因转移主要在G-菌之间进行。BF菌之间的质粒接合率比游离状态的大许多，携带耐药、毒素、性菌毛等基因的质粒能够在细菌之间迅速传播，使BF菌产生多重的抗药性，毒素及性菌毛普遍生长。性菌毛具有粘合不同菌细胞的作用，使BF结构更稳定。（3）转导（Transduction）即以噬菌体为载体，将供体菌DNA片段转移到受体菌并使之获得新遗传性状的过程。G-菌和G+菌均可发生转导作用。一些噬菌体携带聚糖酶（Polysaccharide depolymerase）基因，产生的聚糖酶能分解胞外多糖及BF。噬菌体正在被研究用来防控BF的感染。

4 结语

PA作为研究细菌生物膜（BF）的模型，其BF胞外基质的结构组成和生物学功能、BF形成和发育的显微过程及其调控机制QS和c-di-GMP调节系统研究得较为详尽，sRNA等调节系统的研究有了端倪。BF胞外多糖Psl、Pel和藻酸盐合成的有关基因及其酶系只有零散的初步确认，至于胞外多糖的三维结构、合成代谢途经涉及的酶和酶蛋白的空间结构以及基因表达调控的分子机制，则很少研究，这些都是今后PA及其他细菌BF的研究努力的方向。胞外多糖是形成BF的主要EPS，只有认识了它的合成途径和分子调控机制及其酶蛋白的空间结构，才能够有效地筛选和设计药物，建立防治细菌BF感染的有效措施。