CRISPR/Cas9基因编辑技术研究进展

陈楠楠

（苏州大学，江苏苏州 215000）

在CRISPER-Cas9基因编辑技术创建之前，人们已找到两种可以特异性切断DNA双链的酶，一种是锌指核酸酶（ZFNs），另一种是利用类转录激活因子效应物核酸酶（TALENs）。ZFNs是由多个锌指基序串联成的DNA识别域和非特异性核酸内切酶FokⅠ的羧基端功能域组成的融合蛋白，当两个ZFN分别结合到DNA的两条链上间隔5～7个碱基的靶序列后，进而激活FokⅠ核酸内切酶的剪切结构域，使DNA在特定位点产生双链断裂。但是，锌指基序同其靶序列的对应性并不特异，而且在基因组上找到合适的ZFN靶点也比较困难。TALENs是将特异性DNA结合结构域TALE代替ZFNs的锌指基序改造而成，但是TALE的识别位点有限。CRISPR/Cas9技术有效的利用了RNA-DNA的特异配对特性，并简化了设计过程，使应用范围更广泛。

1 CRISPR序列的发现（1987—2002年）

1987年，日本的Nakata实验室在分析大肠杆菌基因iap及临近序列时发现在iap基因的3'端存在多个含有29个碱基且高度同源的重复序列，这些重复序列之间包含32个碱基的间隔序列。真正对这些序列着迷的是FranciscoMojica。他的导师在前期研究中发现盐的浓度会影响Haloferaxmediterranei DNA酶切片段的大小，Mojica便寻其中的原因。他在分析DNA片段的序列时发现了与Nakata实验室所发现序列类似的“重复-居间序列-重复”序列[1]。随后的几年里，Mojica在多种微生物中都找到了类似的序列，并意识到这些序列可能在微生物中发挥重要作用。后来，Mojica将这种“重复-居间序列-重复”序列命名为SRSRs。到2000年，Mojica在20种不同的微生物基因组中发现了类似序列[2]。两年后，Ruud Jansen在研究这些序列过程中发现了许多与其关联的核酸酶。与Mojica交流后，这种序列结构被正式命名为CRISPR，与之相关的核酸酶则被命名为Cas[3]。虽然人们鉴定到了大量CRISPR序列，但对其生物学功能则毫无所知。

2 CRISPR功能的初步探索（2002—2005年）

得益于数据库的不断丰富，在2003年，Mojica通过BLAST发现来自E.coli的居间序列能匹配侵染E.coli的P1噬菌体序列，而包含这些居间序列的E.coli菌株对P1噬菌体具有显著的抗性。经过一周的艰苦努力，Mojica分析了4500条居间序列，找到了88条有资料可查的序列，其中2/3的序列为病毒或外源质粒的序列，他意识到CRISPR/Cas系统可能与细菌的获得性免疫有关[4]。同一时期，法国的两个实验室也分别独立得出了类似的结论。就职于法国国防部的Gilles Vergnaud在分析61份Y.pestis样本后，得出了与Mojica一致的结论，即CRISPR与细菌的获得性免疫有关[5]。同时，Alexander Bolotin提出了微生物中CRISPR序列染色体外起源的假说[6]。

3 CRISPR/Cas免疫系统的解析和建立（2005—2012年）

2005年开始，CRISPR得到了更多的重视。2005年，Philippe Horvath等在法国罗地亚食品公司成立了一个研究小组，研究Mojica等人提出的CRISPR可能与细菌的获得性免疫相关的假说。他们建立了由一个对噬菌体敏感的S.thermophilus菌株和两个噬菌体组成的研究体系，发现菌株对噬菌体抗性的获得与菌株CRISPR位点获得噬菌体来源的序列相关[7]，当噬菌体中相应的序列发生突变后，该菌株的噬菌体抗体则丧失。在后续的研究中，他们收集了大量具有不同程度免疫缺陷的菌株，并利用这些资源证实Cas7对菌株在CRISPR位点获得噬菌体来源的序列是必需的，而与序列获得后的抗性无关；而酶学专家VirginijusSiksnys证实，Cas9对菌株维持噬菌体抗性是必需的[6]。同一时期，在瓦格宁根大学的实验室中，John van der Oost和EugeneKoonin合作，利用E.coli建立了另外一个研究CRISPR与细菌获得性免疫关系的研究系统，并分析了其中的5个Cas蛋白（Cascade）的功能[8]。他们发现Cas能将CRISPR位点转录来的RNA前体剪接为61个碱基大小的成熟crRNA（CRISPR RNA）。为了验证crRNA对于CRISPR介导的免疫抗性是必需的，他们在细菌中建立了第一个人工CRISPR/Cas系统，证实了其介导细菌抗噬菌体的能力，并猜测crRNA靶向DNA而不是传统认为的anti-RNA。

证实CRISPR系统靶向DNA的是卢西亚诺·马拉夫尼（Luciano Marraffini）等人。马拉夫尼在芝加哥大学攻读博士学位时，接受了噬菌体遗传学权威人物Malcolm Casadaban的建议着手研究CRISPR。当时人们已普遍怀疑CRISPR anti-RNA理论，于是马拉夫尼大胆推测，CRISPR能像限制性内切酶一样直接切割DNA。后来，马拉夫尼与Erik Sontheimer合作，证实CRISPR可以像抵御病毒一样破坏转化的质粒[9]。为了进一步证实此事，他们构建了一个体外CRISPR免疫系统，确证CRISPR靶向DNA。他们甚至通过改造CRISPR免疫系统，在真核细胞中实现对染色质DNA的剪切。但马拉夫尼等人在设计这些实验时并不知道是哪个Cas起到了DNA内切酶的功能，这导致了他们的实验设计存在大量问题，因此没有引起人们的重视。最终，Sylvain Moineau等人利用手中的免疫缺陷菌株研究发现切割质粒取决于Cas9核酸酶。当他们对质粒进行测序时，发现切割发生在PAM序列上游3个核苷酸处，这一关键序列特征与他们早期论文中所描述的一致[10]。

尽管CRISPR/CAS9系统已经完整，但还有一个谜团，即被称为trans-activating CRISPR RNA（tracrRNA）的小RNA。tracrRNA最早由Emmanuelle Charpentier在病原菌中发现，后经JörgVogel分析发现该小RNA是由紧邻CRISPR的序列转录而来，并包含一个由25个碱基组成，与CRISPR序列互补的序列。后经基因敲出实验证明，tracrRNA指导crRNA的成熟过程[11]。后经Siksnys等人的研究表明，tracrRNA还有另一个关键作用，即对于Cas9核酸酶复合物的形成是必需的[12-13]。就在Siksnys等人解析Cas9的酶学结构时，Charpentier与结构生物学家JenniferDoudna开展合作，发现从E.coli中纯化的Cas9能与纯化的crRNA和tracrRNA在体外形成功能复合体，更重要的是，他们发现将crRNA和tracrRNA融合成一条RNA（sgRNA）时，Cas9复合体的功能不受影响，并指出“该系统在RNA指导的基因组编辑方面具有巨大潜力”[12]。

4 CRISPR/Cas9技术的历史性突破（2012—2013年）

在解析CRISPR/Cas免疫系统的过程中，有两件具有里程碑意义的成果，即CRISPR/Cas免疫系统在不同微生物间的移植和在体外的成功重建。在接下来的研究中，科学家张峰取得了首屈一指的成果。当时TALENs研究刚兴起，张峰等人与来自SangamoBioSciences的另一实验室分别成功地将TALENs应用在哺乳动物细胞中。2011年2月，张峰首次接触到CRIAPR/Cas9系统，两个月后他便在哺乳动物细胞中实现了sgRNA介导的荧光报告基因的表达调控，但效果并不理想。接下来的一年中，张峰对CRIAPR/Cas9系统进行了优化。2012年，他建立了一个由Cas9、tracrRNA和CRISPR序列三种元件组成的基因调控系统，以及包含16个基因的CRISPR文库。他发现该系统可以同时准确高效地突变多个基因序列。接下来，他检测了由Cas9和sgRNA两种元件组成的系统，发现sgRNA的3'端发夹结构在激活Cas9的过程中发挥重要作用[14]。

5 后CRISPR/Cas9时代（2013年至今）

自CRISPR/Cas9技术被证明可以高效准确编辑哺乳动物基因序列后，关于CRISPR/Cas9的科学报道迅速席卷生命科学的各个领域，CRISPR/Cas9技术在应用方面实现迅猛拓展，概括来讲可以分为基因组编辑、转录调控、RNA调控及基因组定位。除了科研领域，CRISPR/Cas9还对社会思想带来了巨大冲击，特别是基因编辑婴儿的诞生，引发了关于CRISPR/Cas9伦理的广泛讨论。但无论如何，CRISPR/Cas9基因编辑技术的出现为人类战胜遗传性疾病及癌症等严重疾病带来了新的希望，具有不可估量的价值。