高糖对人肾小管上皮细胞转分化的影响

张楠楠， 李凤祥， 宋志鹏， 康金森， 李学军， 毛新民,4

(1新疆医科大学省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室, 2新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐 830011；3北京大学医学部基础医学院药理学系, 北京 100191； 4新疆医科大学中医学院， 乌鲁木齐 830011)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病微血管并发症之一，为终末期肾衰的主要原因之一[1]，目前几乎占所有终末期肾脏疾病的50%[2]，1型和2型糖尿病有20%～40%发展成为糖尿病肾病，严重威胁着糖尿病患者的生命及生活质量。其病变进展最终导致肾脏硬化、纤维化。如今，研究肾间质纤维化以及肾小管上皮细胞向间充质细胞转化 (epithelial to mesenchymal transition，EMT)的发病机制、阻断参与纤维化的信号通路，延缓糖尿病肾病纤维化，已成为当前的研究热点。本文通过用高糖(HG)干预人肾小管上皮细胞(HK-2)，建立体外糖尿病肾病模型，为课题组后期糖尿病肾病机制的研究打下基础。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1 细胞株 人近曲小管上皮细胞(HK-2)，购自中国典型培养物保藏中心，培养条件为含10%胎牛血清、0.2%双抗的MEM培养基，置于5%CO2、37℃培养箱。

1.1.2 试剂 类胎牛血清/FBS(美国,GBICO)，MEM培养液(美国，HYCLONE)，磷酸盐缓冲液/PBS(以色列，BI),细胞增殖与活性检测试剂盒/MTS(美国，PROMEGA),D-Glucose(美国，SIGMA),一抗E-cadherin，FN，β-actin(美国,ABCAM),一抗GAPDH以及二抗(中国,BIOSS)。

1.1.3 主要仪器 GelDocXR+凝胶成像分析系统(Bio-Rad,美国)，156-8001垂直电泳槽(Bio-Rad,美国)，ZESS Axio Observer Z1倒置显微镜(ZEISS，德国)，5427R高速冷冻离心机(Eppendorf,德国)，Steri-Cult CO2培养箱(Thermo，美国)。

1.2实验方法

1.2.1 细胞活性与增殖试验 在96孔板中接种约每孔5 000个细胞，100 μL，置于5% CO2、37℃培养箱中培养24 h后，弃上清液，用无血清的培养基配置不同浓度的D-glucose溶液，每孔加100 μL，设置4个复孔，继续培养24/48 h，然后每孔加入MTS溶液20 μL，37℃ 2 h后在酶标仪中于490 nm处测吸光度(实验重复3次)。

1.2.2 Western Blot试验方法 接种HK-2细胞于10 cm的细胞培养皿中，待细胞融合至70%～80%后，去掉上清液，加不同浓度的D-glucose的MEM培养基(不含血清)干预24/48 h，然后用RIPA裂解液提蛋白(含1%蛋白酶抑制剂，1%磷酸酶抑制剂，1%EDTA),BCA试剂盒测蛋白浓度，加4×loading buffer在100℃变性蛋白5 min, 最终蛋白的浓度定至2 μg/μL，上样10 μL，制备10%的聚丙烯酰胺凝胶进行上样跑电泳(80 V浓缩胶，120 V分离胶)，至溴酚蓝指示剂达到玻璃板0.5 mm处停止电泳，在100 V条件下冰浴转模，5%的脱脂奶粉封闭1.5 h，4℃摇床中孵育一抗(E-cadherin 1∶1 000, FN 1∶8 000, β-actin 1∶2 000,GAPDH 1∶2 000)过夜，TBST洗3次，每次10 min，避光常温孵育二抗2 h，TBST洗3次，每次10 min，加显色剂显色，凝胶成像仪上拍照，测灰度值(实验重复3次)。

2 结果

2.1高糖对HK-2细胞活性的影响高糖是DN的独立危险因子,能使一些重要致纤维化细胞因子生成增加,进一步诱导EMT的发生，所以用D-glucose造EMT模型。从细胞水平确定造模浓度如图1 所示，随着高糖浓度和作用时间的增加，HK-2细胞活性呈现剂量依赖性的下降。高糖作用24 h时，与Control组相比,高糖在其浓度为60 mM时活性明显下降(P<0.05)。高糖作用48 h时，与Control组相比，高糖在其浓度为30 mM出现了明显下降(P<0.05)，60 mM时差异更显著(P<0.01)。

2.2高糖对HK-2细胞形态的影响不同浓度的高糖干预HK-2细胞48 h后，可见部分细胞发生明显的形态学改变，表现为成纤维细胞样外观: 细胞拉长、肥大，呈长梭形，由椭圆形贴壁生长变为长梭形，丧失其铺路石样生长方式(EMT特征)。高糖浓度越大其形态变化越明显，且细胞活性越差，细胞数量越少(图2)。

2.3高糖抑制E-cadherin的表达，促进FN的表达从蛋白水平确定造模浓度，与Control组相比，HK-2细胞转分化前的标志物E-cadherin随着高糖浓度的增加表达量降低(图3)。与Control组相比，HK-2细胞转分化后的标志物FN随着高糖浓度的增加表达量逐渐增加，到150 mM时FN表达量下降可能是因为细胞凋亡的缘故(图4)。因此选择高糖60 mM 为造模浓度，干预时间为48 h。

[细胞活性百分比用均数±标准差表示(n=3)，与Control组相比, *P<0.05， **P<0.01, ***P<0.001]

Control HG 30 mM HG 60 mM HG 90 mM

[E-cadherin的蛋白表达量以均数±标准差表示(n=3); 与Control组相比, *P<0.05, **P<0.01， ***P<0.001]

[FN的蛋白表达量以均数±标准差表示(n=3); 与Control组相比, *P<0.05, **P<0.01]

3 讨论

高糖是DN的独立危险因子,高糖能使一些重要致纤维化细胞因子生成增加,进一步诱导EMT过程。加速肾脏纤维化是 DN 发病的潜在机制之一。研究表明D-葡萄糖可通过调节不同的通路从而促进肾小管上皮细胞间质转化。本研究通过MTS细胞活性实验,显微镜观测细胞形态变化，以及Western Blot方法确定高糖的建模浓度为60 mM。与Control组相比，高糖以60 mM浓度作用48 h时，HK-2细胞活性显著下降；细胞形态也发生明显变化：由椭圆形贴壁生长变为长梭形样；HK-2细胞转分化前的标志物E-cadherin表达量明显下降，转分化后的标志物FN明显增加。

DN以细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)蛋白的积累为特征(主要包括肾小球和肾小管间质的各种胶原蛋白，层黏连蛋白和纤维连接蛋白以及基底膜的增厚),ECM的沉积随后导致肾纤维化—肾小管间质纤维化、肾小球硬化、炎性介质的渗透，并激活α-SMA阳性的肌成纤维细胞[3-6]。DN在发病早期即可出现糖尿病肾病纤维化，且不依赖肾小球病变直接加速肾功能恶化。在尿糖、尿蛋白、氧化应激等病理性刺激下，肾小管上皮细胞会发生多个结构和功能的改变[7]，部分肾小管上皮细胞为对抗环境的损伤，逃脱潜在的凋亡，通过表型转化为肌成纤维细胞，进入间质，异常合成细胞外基质，这一过程即为肾小管上皮细胞向间充质上皮细胞转分化。而其中胶原、黏连蛋白等ECM组成物在肾小球系膜和肾小管间质过度积累，占据正常组织的空间，最终导致蛋白尿、高血压及肾功能损害[8]。因此，探索肾间质纤维化以肾小管的EMT的发病机制、信号通路，延缓糖尿病肾病纤维化，已成为当前的研究热点。

肾病纤维化的精确程度虽然难以具体量化，但大量文献表明EMT是糖尿病肾病肌成纤维细胞的主要来源。EMT主要发生于近曲小管细胞和足细胞。越来越多的证据表明EMT是患病肾脏中肾间质肌成纤维细胞的主要途径[9-10]。Loeffler等[11]提出，EMT的存在在DN纤维化的发展过程中是不能忽视的，肾小管上皮细胞和内皮细胞具体在DN中转化成肌成纤维细胞的量还未知。肾小管间质纤维化是各种肾脏疾病进展到终末期肾衰竭的共同途径和主要病理基础,研究证实肾小管间质的损害程度与慢性肾衰竭患者的肾功能损害程度呈正相关。因此,肾小管间质纤维化越来越受学者们的重视。故本文通过用高糖干预人肾小管上皮细胞(HK-2)，建立体外糖尿病肾病模型，为课题组后期糖尿病肾病机制的研究打下基础。