基于线粒体COⅡ基因和D-loop区序列对江西安南光唇鱼(Acrossocheilus)物种鉴定及系统发育位置分析

薛艳洁，潘 娜，李明云

(宁波大学 应用海洋生物技术教育部重点实验室，宁波 315211)

光唇鱼是鲤形目、鲤科、鲃亚科、光唇鱼属鱼类的统称，分布于我国浙江、江苏、安徽、福建省及台湾等地的溪流中。光唇鱼因观赏价值比较高，再加之细嫩的肉质、鲜美的味道，广受消费人群的欢迎[1]。目前，对于光唇鱼的研究主要侧重于形态学特征[2]、分类学[3]、组织学[4]等方面，而迄今为止分子生物学方面的研究甚少[5]。对于光唇鱼属鱼类的分类地位基本上都是根据形态特征来鉴别。传统的依据形态特征判定物种的方法难以排除因环境因子、种内个体变异以及雌雄两性差异等干扰引起的物种变异，仍存在一定的局限性。借助线粒体DNA(mtDNA)对光唇鱼属鱼类进行分析，可进一步在分子层面上证实其形态学分类的正确性，确定其系统发育地位。

线粒体DNA分子结构简单、几乎不发生重组、呈母系遗传、进化速度快，目前在系统进化、分类学、群体遗传以及动物保护生物学等研究方面得到了普遍的应用[6-7]。近年来常用的分子标记有Cytb、ND、COI、COⅡ和D-loop等。细胞色素氧化酶亚基Ⅱ(cytochrome oxidase subunitⅡ，COⅡ)是线粒体的编码基因之一，其基因进化的速率较快，基因序列和氨基酸序列的趋异性显著[8]，目前COⅡ基因研究主要集中在昆虫分子系统学，而在鱼类的系统进化中的报道较少[9-12]。D-loop区域(displacement loop region)在mtDNA基因组中的碱基突变率最高，长度变异最大，其碱基替换率比mtDNA基因组的其他区域高5～10倍，因此，D-loop区域比较适合于近缘种以及种内不同群体之间的遗传差异分析[13]。本文结合形态学观察，扩增和测定了采自江西赣州安南的光唇鱼的COⅡ和D-loop序列，并通过mtDNA分子标记分析其系统发育地位，研究结果可以为光唇鱼属鱼类的分类研究等方面提供参考依据，同时可以为江西赣州安南光唇鱼的渔业资源的开发研究提供相应的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料为江西赣州安南采捕的野生光唇鱼，实验样本共7尾，采捕后进行活体标记(HT157型动物标签)，剪取少量尾鳍，经液氮速冻后，置于-80℃保存，用于DNA的提取。

1.2 方法

观察实验样本的外部形态特征，并对其进行常规参数的测量(头长、体高、吻长、眼后头长、眼间距、眼径、背鳍式、臀鳍式、侧线鳞、鳃耙)。

DNA提取采用常规的酚-氯仿法进行[14]，DNA样品加20 μL TE缓冲液溶解，于-20℃中保存备用。

COⅡ扩增引物根据温州光唇鱼线粒体全序列(GenBank登录号：NC_020145)设计(上游引物序列：5′-GTCTTTTAGCCCCAAGCT-3′；下游引物：5′-GTCTGANGTCACCAATCT-3′)。D-loop扩增引物使用黄志坚等[15]设计的鱼类引物序列(上游引物序列：5′-CACCCYTRRCTCCCAAAGCYA-3′；下游引物序列：5′-GGTGCGGRKACTTGCATGTRTAA-3′)。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

PCR扩增体系如表1所示。PCR扩增程序为：94℃预变性300 s；94℃变性40 s，退火60 s(COⅡ退火温度为48℃，D-loop退火温度为57℃)，72℃延伸60 s，30个循环；72℃再延伸600 s。扩增产物的检测用1.5%琼脂糖凝胶电泳。

PCR产物的回收使用胶回收试剂盒(上海博彩生物科技有限公司)，回收后与pMD-19载体(TaKaRa)连接，随后转化大肠杆菌TG1感受态细胞，于含氨苄青霉素的平板上烘箱过夜培养(37℃)，挑取阳性克隆产物进行测序[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

表1 PCR扩增体系Table 1 PCR amplification system

利用Clustal X软件对所得到的江西赣州安南光唇鱼COⅡ、D-loop序列与GenBank中获取的其他鲃亚科鱼类COⅡ和D-loop序列进行序列多重对位排列和手工校正[16]；利用MEAN 4.0软件分析各序列的碱基含量和变异情况[17]，序列遗传距离的计算利用Kimura 2-parameter模型。分别以斑马鱼(Danio rerio，GenBank登录号：NC_002333)的COⅡ序列和D-loop序列为外群，构建最大似然法(ML)分子系统树，bootstrap 1000次检查各分支的置信度。

2 结果与分析

2.1 形态特征

经过观察，采集的江西赣州安南野生光唇鱼体长而侧扁，腹部较圆，背部上半部分呈灰黑色，下半部分呈黄色，腹面呈黄色或者黄白色相间。鼻孔前略成凹陷，头长(2.5±0.2)cm小于体高(2.7±0.3)cm。吻稍尖，吻长约等于眼后头长。须两对，口角须略长，吻须稍短；眼间隆起，间距(1.2±0.1)cm远大于眼径(0.5±0.1)cm。唇肉质肥厚，下唇分两侧瓣，唇后沟较深，向前延伸至颏部，接近下颌中线，而上唇包于上颌外，较完整。光唇鱼的背鳍式为DⅡ-9，背鳍末跟不分枝，背鳍第一根分支鳍条与腹鳍起点相对；臀鳍式为A-6或A-7；侧线鳞为39-41(6/A4)；鳃耙为10-13，体侧没有6条垂直条纹。

图1 基于线粒体DNA COⅡ序列构建的鲃亚科最大似然法系统发育树Figure 1 Phylogenetic tree (NJ) based on COⅡ gene fragments of Barbinae Bootstrap=1000注：JXAnnan-江西赣州安南光唇鱼

2.2 COⅡ和D-loop序列的组成和遗传距离

经过测序，在江西赣州安南光唇鱼中，COⅡ引物的扩增产物序列长度为775 bp，COⅡ基因序列的全长均为691 bp；7尾江西赣州安南光唇鱼的COⅡ序列相似度为99.81%，共存在6个碱基转换位点，其中包括4个T/C转换位点和2个A/G转换位点。江西赣州安南光唇鱼COⅡ序列中碱基A、T、G、C的平均组成含量分别为31.00%、25.80%、15.30%和27.90%，A+T的含量(56.80%)要高于G+C的含量(43.20%)。

D-loop引物在江西赣州安南光唇鱼中的扩增产物序列长度为1116～1123 bp，D-loop基因序列的全长为937～944 bp；7尾江西赣州安南光唇鱼的D-loop序列相似度为99.11%，共存在16个碱基转换(A/G、T/C)位点和8个碱基插入或者缺失(A、T)位点。江西赣州安南光唇鱼D-loop序列中碱基A、T、G、C的平均组成含量分别为35.60%、32.30%、12.00%和20.00%，A+T的含量(67.90%)要大于G+C的含量(32.00%)。

COⅡ和D-loop序列的测序结果显示，两者序列中碱基G的含量较其他3种碱基明显偏低，碱基的组成偏向性较明显。

江西赣州安南光唇鱼的COⅡ基因编码的氨基酸数量均为230个，其中都含有一个起始密码子ATG和不完全的终止密码子T。群体内COⅡ、D-loop基因的平均遗传距离分别为0.0075、0.0050。与其他鲃亚科鱼类的遗传距离分析结果显示，江西赣州安南光唇鱼与半刺光唇鱼的遗传距离最近，COⅡ、D-loop序列遗传距离分别为0.0130、0.0260。

图2 基于线粒体DNA D-loop序列构建的鲃亚科最大似然法系统发育树Figure 2 Phylogenetic tree (NJ) based on D-loop gene fragments of Barbinae Bootstrap=1000注：JXAnnnan-江西赣州安南光唇鱼

2.3 基于COⅡ和D-loop序列的江西赣州安南光唇鱼系统发育分析

江西赣州安南光唇鱼以及其他鲃亚科鱼类基于COⅡ序列的最大似然法(ML)分子系统发育关系树如图1，结果显示：光唇鱼属和白甲鱼属的13种鱼聚为一大簇；赣州安南光唇鱼与半刺光唇鱼聚为一小簇，其COⅡ序列同源性为98.70%；然后与薄颌光唇鱼、光唇鱼、温州光唇鱼聚成一大簇；宽口光唇鱼、稀有白甲鱼和高体白甲鱼三者则单独聚为一簇，然后与宽口光唇鱼、多彩鲃、台湾铲颌鱼、白甲鱼、粗须白甲鱼、小口白甲鱼和多鳞白甲鱼聚为一大簇。

江西赣州安南光唇鱼以及其他鲃亚科鱼类基于D-loop序列的最大似然法(ML)分子系统发育关系树如图2。结果显示：光唇鱼属和白甲鱼属分别相聚后再聚为一簇，而台湾铲颌鱼、稀有白甲鱼和白甲鱼也聚在光唇鱼属的簇中；江西赣州安南光唇鱼与半刺光唇鱼聚为一簇，其D-loop序列同源性为98.69%。另外，其他鲃亚科鱼类无须魮属、金线鲃属、突吻鱼属、鲈鲤属各鱼类和倒刺鲃属的中华倒刺鲃分别聚在一起后形成一簇，与光唇鱼属和白甲鱼属形成一大簇。

3 讨论

光唇鱼属鱼类的鉴定长期以来主要是依据传统的形态学方法，通过观察比较体色、口唇结构、背鳍等形态特征差异来进行分类。对比同族的其他属，光唇鱼属的主要差别在于：吻有褶；唇肉质，包于上下颌外，上下唇相连在口角处；下唇两侧瓣之间有间隔；口下位；下颌前缘有角质；两对须；背鳍尾部不分支，鳍条骨化，后缘则光滑或有锯齿[19]。本研究对江西赣州安南的野生光唇鱼进行形态学观察，结果显示其吻稍尖，须两对，眼间隆起，唇肉质肥厚，下唇分两侧瓣，唇后沟较深，向前延伸至颏部，接近下颌中线，而上唇包于上颌外，较完整，背鳍末跟不分枝，背鳍第一根分支鳍条与腹鳍起点相对。根据伍献文[19]、毛节荣[20]、单乡红[21]、袁乐洋[3]等的描述可以确定该鱼类为光唇鱼属鱼类，与半刺光唇鱼的形态最为相似，但仍不能确定具体种。由于光唇鱼属鱼类在两性差异、不同地理群体以及体色上有很大的不同，所以在进行物种鉴定时容易产生鉴定错误。有些光唇鱼属鱼类幼鱼体侧存在垂直条纹，而成鱼则垂直条纹消失或者少数在鱼体后半部分有1～3条垂直条纹。例如两个亚属的模式种，厚唇光唇鱼和台湾光唇鱼，两者均分布于台湾岛诸水系，除口唇结构的差别外，两者在体色、吻端及眼眶骨前缘有无珠星等性状均存在差别，而这些性状的差别和同属的其他鱼类所表现出来的雌雄之间的差别基本一致[3]。

利用线粒体DNA(mtDNA)的分子分类学方法对物种进行亲缘关系探讨以及系统进化分析，可以有效避免由于肉眼形态特征观察以及地理种群不同带来的误差，对物种确定很有必要[22-23]。董徐辉等[12]测定分析了日本鬼鲉(Inimicusjaponicus)的COⅡ基因与鲉形目鱼类进行系统发育分析，其结果与传统分类方法的基本一致。任巍等[24]测序和分析了挂榜山小鲵(Hynobiusguabangshanensis)线粒体D-loop区，并构建了分子系统发育树，结果显示挂榜山小鲵与小鲵属同属一个分支，其结果与Zhang等[25]提交的中国小鲵聚为一小支，与传统分类学方法的结果无异分析，均认为挂榜山小鲵属于小鲵科小鲵属。

本研究对江西赣州安南采捕的野生光唇鱼进行COⅡ和D-loop序列的扩增以及测序，并与已经发布的鲃亚科鱼类进行COⅡ和D-loop序列比对分析以及系统发育构建。结果显示赣州安南光唇鱼则和半刺光唇鱼形成一个紧密的簇，赣州安南光唇鱼与半刺光唇鱼的COⅡ、D-loop序列遗传距离分别为0.0130、0.0260，序列相似性分别为98.70%、98.69%，而NEI[26]认为种群间遗传距离小于0.0500为同一物种，因此可推断赣州安南光唇鱼和半刺光唇鱼为同一种。

此外，在应用两个片段序列进行鲃亚科系统发育分析时发现，D-loop比COⅡ进化速率稍快，选择压力更小些，在研究亲缘关系较远的物种种间关系时，D-loop优于COⅡ。形态学特征的观察结果显示江西赣州安南采捕的野生鱼类属于光唇鱼属鱼类，与半刺光唇鱼最为相似，同时结合D-loop和COⅡ的2种分子标记的结果更加准确的判定了其与半刺光唇鱼为同一种。这为光唇鱼属所有物种在内的分子系统发育分析提供了资料，也为江西赣州安南光唇鱼的开发利用提供了很好的基础。

另外，在分析COⅡ和D-loop的系统发育树时发现光唇鱼属和白甲鱼属鱼类关系比较近，多彩鲃(A.barbodon)和宽口光唇鱼(A.monticola)与白甲鱼属鱼类聚在一簇上。而袁乐洋[3]从光唇鱼属中移除了宽口光唇鱼(A.monticola)和多耙光唇鱼(A.clivosius)，因此对于多彩鲃(A.barbodon)和宽口光唇鱼(A.monticola)分类地位有待于进一步研究。