外泌体在多囊卵巢综合征中的研究进展及其检测手段

刘琳，彭小彧，张晓梅，王丽萍，张树成，王宁，吕芳

(1.扬州大学临床医学院/江苏省苏北人民医院妇产科生殖医学中心，扬州 225001；2.大连医科大学妇产科，大连 116044；3.扬州大学临床医学院/江苏省苏北人民医院生物样本库，扬州 225001；4.国家卫生健康委科学技术研究所，北京 100081)

多囊卵巢综合征(PCOS)是以无排卵性不孕、激素水平紊乱为特征的内分泌疾病，影响世界约8%～10%育龄期妇女，其具体发病机制目前尚未明确。外泌体是由多种细胞分泌的小细胞囊泡，可释放有活性的蛋白、mRNA和miRNA等。有研究推测外泌体在多囊卵巢综合征患者体内充当类似“电话线”的角色，将信号通过血液循环传递至多个器官从而参与发病。本文检索Pubmed、Springer-Link、Elsevier Science等数据库的相关文献做简要综述。

一、外泌体的基本概念

1.外泌体的生物学特性：“外泌体”最初是指各种培养细胞中携带5’-核苷酸酶活性细胞释放的囊泡，目前主要指由多种细胞分泌的纳米级微囊泡[1]。研究表明，几乎体内的任何细胞均可分泌产生外泌体，其广泛存在于血液、乳液、胎盘、羊水中，还可从腹腔积液、卵泡液中分离得出[2]。外泌体直径约30～100 nm[2]，因此它既可以通过质膜受体直接激活靶细胞，也可以作为载体转运蛋白质、脂质、长链非编码RNA(lncRNA)、细胞器甚至病毒进入靶细胞内，作为信号因子改变靶细胞生物活性及功能[3]。外泌体的成分有主要组织相容性复合物(MHC，如MHCⅠ类、MHCⅡ类分子)、整合素、热休克蛋白及生物酶类等。不同细胞来源的外泌体所含RNA、蛋白质和脂质均有所差异，功能也不尽相同[4]。外泌体参与细胞间信号转导的生物学过程、参与细胞增殖和代谢的过程；外泌体携带的核酸可促进肿瘤细胞的迅速增殖和肿瘤部位血管生成等[5]。外泌体详细信息可登陆外泌体数据库(http：//www.exocarta.org/)查询。截止2019年3月20日，该数据库共收录蛋白质数据41 860条，mRNA数据4 946条，miRNA数据2 838条和脂质数据1 116条。

2.外泌体的形成与释放：外泌体的生成有多种机制，其中较为普遍是细胞膜向内凹陷，形成含有多种膜表面蛋白、外源性的抗原及脂类的早期内涵体；随后内涵体在细胞内再次内陷，包裹胞质内的蛋白、核酸等形成多囊泡小体；最后多囊泡小体与细胞膜融合，将其中的小囊泡释放到细胞外，形成外泌体[6]。

3.外泌体与靶细胞间的相互作用机制：目前，外泌体与靶细胞间相互作用最有可能的三种机制分别为：外泌体直接与靶细胞结合；外泌体被靶细胞完全内吞；外泌体通过其表面的特性蛋白分子与靶细胞结合。

二、外泌体与PCOS

PCOS临床诊断虽有鹿特丹标准，但地域和种族不同、患者的临床表现具有高度异质性为PCOS诊断和检测带来困难，早发现早诊断对于合并不孕症的PCOS患者具有十分积极意义。研究表明，卵泡发育异常与PCOS患者的发病密切相关。正常卵巢内会呈现多个不同发育阶段卵泡并存现象，而卵泡发育过程中，卵泡液是卵母细胞生存的直接内环境，卵泡液的含量及成分(如生长因子、激素水平等)在不同的阶段代谢物质不同，其变化直接影响卵泡的发育及成熟[7]。

Huang等[8]通过微阵列基因芯片技术发现PCOS与非POCS患者卵丘细胞中lncRNA的表达明显不同。外泌体内的mRNA可稳定的表达于唾液、血液和卵泡液中，不易受内环境影响而变化，便于检测。同时在外泌体中检测到miRNA、lncRNA等的存在[9-10]。2012年da Silveira等[11]首次发现马卵泡液来源的外泌体内含有miRNA及蛋白质，并发现卵巢颗粒细胞可吸收从卵泡液中提取的外泌体。该研究同时证实miR-181A、miR-375等随母马的年龄增长而出现表达下降，证明外泌体携带的miRNA与年龄相关。随后在牛卵泡液外泌体中提取大量的miRNA发现，生长期卵泡液外泌体中miR-654-5p和miR-640呈高表达，而成熟卵泡液外泌体中miR-373呈高表达，表明卵泡液中提取的外泌体有助于卵泡的生长发育[12-13]。检测卵泡液或血液中提取外泌体内特定的RNA表达以协助PCOS患者的早期诊断，具有十分重要的意义。

近期在卵泡液中检测并确定了120个miRNAs及靶基因[14]，有11种miRNAs高表达同时参与生殖途径的内分泌和代谢过程。其中miR-132和miR-320显著降低，其靶基因分别为HMGA2和PAB5B，是两个与PCOS的发病相关的关键基因。而Naji 等[15]研究发现，PCOS患者卵泡液来源的miRNA在女性生殖系统和卵泡形成的正常功能中起着至关重要的作用，并证实在颗粒细胞(GLCs)、滤泡液(FF)和PCOS患者血清中的miR-182、miR-145表达下降，推测miRNA参与PCOS发病进程。Daskalopoulos等[16]研究发现，脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)可增加患PCOS和心血管疾病的风险。随着危险因素的增加，PCOS患者体内的外泌体在体内的循环水平增加[17-18]。上述研究没有很好的同质性，但可推测外泌体内含有的特定表型RNA在PCOS的发病中发挥重要作用，应用于临床检测前需大量实验验证和补充。

三、外泌体分离和检测方法

1.超速离心法：为目前常用的外泌体纯化手段。首先将卵泡液在4 ℃下300×g离心10 min，2 000×g离心20 min，弃沉淀后经10 000×g离心30 min，再次弃沉淀，最后经过100 000×g离心后弃上清液，所得沉淀即为外泌体。此方法优点是提取量多，缺点为提取纯度不足，回收率不稳定，重复离心可能会损伤囊泡，在电镜下外泌体会聚集成块。

2.过滤离心法：过滤离心法是利用生物膜的孔径分离原理对样品进行离心获得外泌体，即利用超滤膜大分子物质留下而小分子物质可通过超滤膜滤出。该方法优点是省时高效，且不易损伤外泌体；缺点是获得的纯度相对不足，且易残留粘附在超滤膜上，降低滤膜寿命。此方法外泌体的产量较少，不足以支持需要大量外泌体的试验的开展。

3.免疫磁珠法：在离心法的基础上，将待测样本与抗体包被的免疫磁珠混匀，室温孵育后将待分离样本缓缓加入到分离柱中，然后将分离柱移出磁性分离器，并用磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗。该方法操作简单且分离纯度较高，能够保证外泌体形态的完整，但非中性pH值会影响外泌体的生物活性，不适用于大体积样本的分离，因此不利于后续功能实验的进行及此方法的推广。

4.ExoQuick Precipitation法：采用ExoQuick试剂盒，将卵泡液以3 000×g离心15 min取上清液，加入沉淀剂(减少囊泡的水化改变溶解度)再次离心弃上清，获得完整的外泌体并且能有效去除提取样品中的杂蛋白。该方法主要依赖于聚合物共沉淀以获取更丰富的外泌体。但其生物活性易受试剂浓度及pH的影响，且试剂盒价格昂贵，不适于大规模外泌体的提取。

5．螺旋超滤法：螺旋超滤法是利用螺旋超滤仪进行外泌体提取。首先将收集的卵泡上清液分别置于2个15 ml离心管中，依次经过300×g和2 000×g4℃离心取得上清液，过滤后经螺旋超滤仪反复超滤3次，并使用 PBS反复冲洗，最后放入Eppendorf管中于-80 ℃冰箱中保存备用。此法可高速、快捷获得外泌体，较为常用。

6.分子排阻色谱法：分子排阻色谱法通过凝胶过滤将囊泡与其它分子相分离，凝胶主要由球形颗粒组成，这些颗粒在特定部位分布有气孔[19]。当样品进入凝胶时，小分子可直接扩散进入气孔，而大分子则直接被洗脱下来，因此大分子比小分子易分离，该方法是利用复杂的生物学特性实现外泌体的分离，是近期才应用于分离囊泡的方法。在实际操作过程中，还应将设备类型、孔径大小及流速等因素考虑在内，以获得纯度较高而功能良好的外泌体。

7.外泌体定量检测方法：采集外泌体首先通过离心、免疫磁珠等方法进行分离和富集，但因纯度不足、缺乏公认的分离方法极大地限制了对外泌体的定量研究，本文收集多种外泌体提取方法进行综合分析。纳米粒子追踪分析(Nanopa rticle tracking analysis，NTA)是一种利用外泌体物理性质来进行定量分析的方法，利用光散射来检测纳米颗粒的分布及浓度的分布，可同时对不同大小及分布的样本进行分析[20]，尽可能减少在处理样本中的污染。电化学传感器是一种利用外泌体的电化学性质对外泌体进行定量分析的方法，此方法具有特性佳、灵敏度高、容易获取的优势。表面等离子体共振(SPR)技术，可以对无标记的外泌体进行实时定量检测，灵敏度高还可省去荧光标记的步骤，方便快捷。

四、治疗及展望

外泌体在许多生物合成过程中发挥至关重要的作用，其携带的RNA和蛋白质含量可反映其起源细胞水平。因此，外泌体的量化研究在未来的研究中显得至关重要[5，21]，特别是对于疾病的早期诊断和早期治疗。PCOS患者体内特殊的内分泌调节状态常与自然流产、妊娠期糖尿病和妊娠期高血压等疾病的发病密切相关[22-23]。由于PCOS有很大的异质性，因此治疗方案通常给予个体化指导、运动指导及促排卵药物，但妊娠结果往往不尽如人意。外泌体作为一种多效的生物活性载体，参与细胞信号转导、废物的管理，由于其性质较为稳定，相对于一般生物标记物，可提供大量特异性和敏感性指标[24]。因此对PCOS患者实时监控外泌体的水平，对于诊断和治疗有十分重要的意义。若外泌体作为诊断生物标记物，可很大程度上提高PCOS诊断的准确性。

经过大量研究证实，外泌体现已成功作为乳腺癌、卵巢癌等多种癌症的循环生物标记物和转移前携带肿瘤相关分子[25-26]。同时也作为一些疾病的潜在标记物，如中枢神经系统退行性病变、阿尔兹海默病等[27-28]，目前也尝试将外泌体转为有前途的治疗疾病的疫苗[29]。进一步研究外泌体，尤其是外泌体内蛋白质、miRNA、lncRNA及circRNA在生殖内分泌系统疾病中的作用机制，将为外泌体作为疾病诊断、治疗和预后的下一代生物标志物奠定基础。