功能性红曲Monacolin K产量控制策略的研究进展

于卓然，洪厚胜，2*

1(南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京，211816) 2(南京汇科生物工程设备有限公司，江苏 南京，210009)

Monacolin K(莫纳可林 K)是红曲菌的次级代谢产物。红曲菌在我国有悠久的生产和应用历史，但一般仅用作天然色素、酿酒、制作腐乳以及中药[1]。近年来，随着生活水平的不断提高，由高胆固醇所引起的冠心病、高血脂、脑血栓、前列腺癌等疾病已威胁着人类的健康，降脂类产品的需求日益增多，由红曲菌天然发酵的以降胆固醇物质莫纳可林K为主要成分的功能性红曲渐渐走进人们的视野。研究表明，与从其他菌类提取或人工合成的洛伐他汀相比，红曲产品中的莫纳可林K结晶少、溶解度高，因而疗效更显著，毒副作用更小[2]。功能性红曲中还含有γ-氨基丁酸、胆碱、麦角固醇、黄酮、不饱和脂肪酸等多种对人体有益的活性物质[3]。由于红曲固态发酵莫纳可林K的产率远高于液态发酵，目前固态发酵仍然是功能性红曲的常用生产方法，随着国内红曲市场以及欧美和日本对我国红曲产品的需求日益增大，如何有效提高功能性红曲固态发酵莫纳可林K的产量已成为红曲发酵产业发展中必须解决的重要问题。

1 红曲菌简介

红曲，古称丹曲，是由红曲菌科真菌红曲菌的菌丝体寄生在大米上所制成的，既是食品，也是具有降血压降血脂功能的传统中药[4]。我国对于红曲的生产和应用已经有一千多年的历史，最早始于唐代，在明代李时珍的《本草纲目》、宋应星的《天工开物》中，都详细记载了红曲的制作方法[5]。按照真菌学的分类方法，红曲菌属真菌界(Eumycophyta)、子囊菌门(Ascomycota)、真子囊菌纲(Euascomycetes)、散子囊菌目(Eurotiales)、红曲菌科(Monascaceae)、红曲菌属(Monascus)[6-7]。红曲菌主要由分生孢子、子囊孢子和菌丝体组成，菌丝分枝繁杂，且具有横隔。菌落形态以在麦芽汁琼脂培养基上为例，菌丝生长初期为白色，成熟衰老后渐渐变为淡红色或紫红色等，因不同品种而异，菌落结构呈绒毡状或皮膜状[8]。

2 红曲的降胆固醇活性物质莫纳可林K

1979年远藤章教授[9]从红曲菌的次级代谢产物中提取了一种可有效抑制胆固醇合成的活性物质，并命名为莫纳可林K。1980年美国学者ALBERTS[10]在土曲霉中发现了同样具有抑制胆固醇作用的活性物质mevinolin，后被称作洛伐他汀(lovastatin)。后经研究证明，二者为结构相同的同一种物质。此后科学界又从红曲菌的代谢产物中发现了多种莫纳可林类物质，包括Monacolin J、Monacolin L、Monacolin M、Monacolin X以及最近由ZHANG等[11]发现的新型莫纳可林类似物Monacolin T、Monacolin U、6a-O-methyl-4,6-dihydromonacolin L、6a-O-ethyl-4,6-dihydromonacolin L等，而这些物质都需要转化为莫纳可林K才能够对胆固醇的合成起抑制作用。

莫纳可林K以酸式和内酯式两种结构形式存在，酸式莫纳可林K的结构与人体内胆固醇合成途径中的HMG-CoA的结构相似，能与限速酶HMG-CoA形成竞争性抑制，从而抑制胆固醇的合成[12]。内酯式莫纳可林K则需要被人体内的羧基酯酶转化为酸式结构，才能够发挥降胆固醇的作用[13]。

3 红曲菌发酵莫纳可林K产量的控制策略

选育高产莫纳可林K菌种、优化培养基、控制环境因子都是提高红曲菌发酵莫纳可林K产量的传统方法，这些方法与红曲固态发酵工艺过程紧密相关，效果显著，实施简单且成本较低，也是目前提高莫纳可林K产量策略的主要研究方向。对于莫纳可林K代谢途径的控制，则是从分子水平上控制莫纳可林K的合成，是高产莫纳可林K研究的新热点，但是对于基因改造菌株的安全性评估仍然难以实现，还需要更进一步的研究[14-15]。

3.1 高产Monacolin K菌株的选育

近年来国内外对于高产莫纳可林K红曲菌菌种的选育进行了大量研究。常聪[16]等通过紫外-氯化锂复合诱变法对红曲菌菌株进行了诱变，筛选出高产莫纳可林K和红曲色素的红曲菌菌株QH12，其莫纳可林K的产率为原始菌株的4.67倍，达到了1.68 mg/g，但是仍未达到《中国药典》规定的红曲质量标准。刘颖等[17]从不同的红曲产品中分离纯化出了96株红曲菌菌株，并通过分子生物学手段筛选出1株高产莫纳可林K的红曲菌株NW3-2，固态发酵产物中酸式莫纳可林K含量为3.20 mg/g，内酯式莫纳可林K含量为2.47 mg/g，此菌株的莫纳可林K产量较高，但其中无法直接利用的内酯式莫纳可林K所占比例较高，可进一步优化发酵工艺提高酸式莫纳可林K的含量。郎天丹等[18]利用正负电子对撞机的E2束流线打靶技术诱变选育出两株高产莫纳可林K的紫色红曲菌株M1-20和M2-4，其原理是利用正负电子对撞机的E2束流线打靶产生的高能混合粒子场对菌株进行辐照，进而使菌株发生突变。祁田甜等[19]通过常压室温等离子体诱变技术选育出突变紫色红曲菌株23，其莫纳可林K的产量达到了428.14 mg/L，较初始菌株提高了111%。虽然选育高产莫纳可林K的菌株可以从源头上提高红曲菌发酵产莫纳可林K的产量，但是红曲菌次级代谢产物中的主要有害物质桔霉素与莫纳可林K同属于聚酮合酶途径，在莫纳可林K产量增加的同时常常也会导致桔霉素含量的增加，因此在选育高产莫纳可林K菌株的同时也应注意其桔霉素的产量。

3.2 优化培养基

对于固态发酵培养基的优化的传统方法主要集中在发酵过程中的碳源、氮源、金属盐和前体物质的优化，陈慎等[20]通过单因素试验结合响应面分析后得出外加营养成分为：甘油1.00%，蛋白胨3.10%，柠檬酸三钠0.13%，此培养基发酵的莫纳可林K产量可达2.87 mg/g，但是此类对于培养基成分含量的基础优化提高的莫纳可林K产量往往不高。红曲菌发酵基质的研究是近年来研究的热点，有些发酵基质不仅可以提高功能性红曲莫纳可林K的产量，也为功能性红曲发酵产品的多样性提供了新思路。ZHANG等[21]使用不同谷物进行了固态发酵实验，发现小米作为培养基质时,莫纳可林K产量最高，其产量达到了7.12 mg/g，此外还对其他发酵条件以及外加碳源氮源等进行了优化，使小米培养基在最佳条件下莫纳可林K产量达到了19.81 mg/g，极大地提高了莫纳可林K的产量。SHARMIN等[22]研究发现，用褐海藻Saccharinajaponica作为发酵基质，在最佳条件下莫纳可林K产量可以达到13.98 mg/g，而且经检测发酵出的莫纳可林K具有较高的热稳定性、SOD含量以及胆固醇抑制活性。卢颖等[23]用燕麦作为发酵基质制成了燕麦红曲，在最佳条件下得到的莫纳可林K含量达到了15.00 mg/g，而且其中淀粉含量为零，这就使得燕麦红曲可以作为糖尿病患者功能性食品。车鑫等[24]选择了15种常见药材分别加入到培养基中进行试验分析，发现陈皮粉、山楂粉、山楂汁、桑叶粉、丁香汁、黑胡椒汁、白芷粉的加入均对红曲发酵产莫纳可林K有促进作用，其中添加陈皮粉发酵的红曲效果最好，莫纳可林K产量为2.118 mg/g，中药成分作为发酵基质的研究为进一步提升传统红曲药食两用功能提供了新的思路。培养基的优化，尤其是发酵基质的研究有利于开发出更多的红曲发酵产品，而且对于莫纳可林K发酵产量和质量的提高往往极其显著，具有广阔的研究前景。

3.3 改变环境因子

环境因子包括温度、光照、pH值、发酵时间等，都能对红曲菌发酵莫纳可林K的产量产生影响，通过对这些工艺参数的控制与优化也是提高莫纳可林K产量的控制策略之一。温度是微生物生长的一种基本环境因素，温度可以影响真菌的生长和其次级代谢产物的生成，MASATOSHI等[25]研究表明，先以最适温度30 ℃发酵红曲，而后转为20 ℃条件下变温发酵的红曲莫纳可林K产量远高于一直以30 ℃恒温发酵的红曲，变温发酵莫纳可林K的含量是恒温发酵的20倍，其原因是在低温时红曲菌经变温刺激由生长转为稳定期，次级代谢产物开始大量生成。光照作为自然界主要的环境因素，对于许多微生物次级代谢产物的生理合成都具有调节作用，研究表明，不同波长的光线能够影响红曲菌的次级代谢[26-27]。张杰[28]通过实验发现，黑暗条件下红曲菌莫纳可林K的产量是蓝光照射条件下的2.3倍，相对于黑暗环境，蓝光会抑制莫纳可林K的生成。杨建等[29]对pH值在红曲发酵产莫纳可林K过程中的影响进行了研究，研究发现在初始pH为6.5时，莫纳可林K含量最大，从而确定最佳初始pH为6.5(自然水)，补水pH为5时，莫纳可林K含量达到最大值13.36 mg/g。赵秀举等[30]通过正交试验设计研究了高温与低温发酵时间对红曲菌发酵莫纳可林K的影响，并优化了功能性红曲菌的发酵条件，优化条件为装料量360 g/L，高温35 ℃发酵5 d，低温22 ℃发酵15 d莫纳可林K产量可达24 mg/g。对环境因子的工艺优化可以与高产菌种选育和培养基优化结合，综合多种策略提高莫纳可林K的产量。

3.4 控制莫纳可林K的代谢途径

控制莫纳可林K的代谢途径是从分子水平上控制莫纳可林K的代谢合成[31]。一方面是通过运用蛋白组学和基因组学等方法分析莫纳可林K的代谢途径和合成相关基因，再通过基因改造或添加能够使相关基因抑制表达或过表达的添加物，达到控制莫纳可林K合成途径的目的[32-33]。LIN等[34]以红曲菌次级代谢产物莫纳可林K生物合成相关基因中的mokE基因为目的基因，构建了mokE基因过表达红曲菌菌株，经测定有3株mokE基因表达量增加，与野生型红曲菌莫纳可林K的产量1.448 mg/g相比分别提高了49.2%、132.5%和188.5%，这说明mokE基因过表达能够提高红曲菌莫纳可林K的产量，在对其孢子、菌丝扫描电镜观察后推测，mokE基因过表达可能是通过影响红曲菌的孢子和菌丝体的生长从而影响次级代谢莫纳可林K的产生。JING HUANG等[35]通过加入亚油酸使红曲菌莫纳可林K的产量增加了135%，原因是亚油酸通过cAMP-PKA信号通路上调mokA和mokH的基因转录水平，而mokA是莫纳可林K合成途径中聚酮化合物合成关键酶PKS酶的编码基因，mokH是与红曲菌次级代谢相关的Zn(II)2Cys6结合蛋白的编码基因，亚油酸使得mokA和mokH的表达更加活跃从而增加了红曲菌次级代谢产物莫纳可林K的产量。ZHANG等[36]研究了谷氨酸对红曲菌莫纳可林K生物合成基因簇表达的影响，结果表明与原始培养基相比红曲菌在谷氨酸培养基中莫纳可林K的产量增加了3.5倍，通过电镜观察分析，谷氨酸使红曲菌的菌丝体显著增加，改变了红曲菌菌丝的渗透性，从而增强了莫纳可林K向细胞外的分泌。另一方面，谷氨酸还上调了莫纳可林K合成途径中mokB、mokC、mokD、mokE、mokF、mokG、mokH和mokI的表达水平，而且谷氨酸还可以产生莫纳可林K合成的底物乙酰辅酶A，以上多方面原因使红曲菌莫纳可林K的产量得以提高。红曲菌莫纳可林K合成途径中相关基因、基因簇的研究起步较晚，许多研究尚未透彻，但上述研究为从分子水平上控制红曲菌莫纳可林K的代谢合成提供了新思路，应作为今后莫纳可林K控制策略研究的重点领域。

4 展望

目前，《中国药典》2015年版已经对功能性红曲中莫纳可林K的含量与测定方法做出了明确规定[37]，且欧美许多国家对于功能性红曲产品进口质量和需求越来越大，检测方法也越来越严格[38]，这使得我国功能性红曲产业面临着新的挑战。

国内外科研人员已经从菌种选育、培养基优化、环境因子控制和代谢途径控制等方面研究提高红曲菌及其发酵产品中莫纳可林K的含量。今后对于莫纳可林K的控制一方面应该运用分子生物学方法研究分析出红曲菌莫纳可林K合成和降解的相关基因与途径，通过促进合成或阻断降解提高莫纳可林K的产量；另一方面现阶段国内功能性红曲工厂的生产工艺大多还处于塑料瓶发酵阶段，发酵周期长、产量低、人工成本高等问题制约着我国功能性红曲产业的发展，许多研究成果由于操作困难、环境限制或成本昂贵难以实现产业化，因此除了要继续深入对红曲莫纳可林K产量控制的研究以外，对于功能性红曲发酵设备的研究已刻不容缓，只有实现了功能性红曲产业的机械化、自动化，才能更好地将红曲莫纳可林K产量控制策略的研究成果应用到实际生产中。