封闭血管内皮生长因子C对角膜淋巴管的抑制和对同种移植物存活的促进作用研究△

方廷兵 严 浩 徐志蓉 冯 梅 王增智

(广东省深圳市南山区人民医院眼科 深圳 518052)

角膜移植是现在比较成熟的技术，通过角膜移植拯救了大量的失明患者，但是现在研究发现角膜移植5年后有复发的情况。通过调查发现，我国因为角膜失明的患者有250万人左右，成为我国第二致盲的原因，角膜移植现在成为唯一使失明患者治愈的治疗手段。正常的角膜没有淋巴管和毛细血管，如果因为某些原因可能会使角膜发生损伤，在修复的过程中，一些炎症因子的参与导致角膜可能发生新生毛细血管和淋巴管的增生，造成患者的失明[1]。近些年有研究证实角膜新生血管和淋巴管均加速高危移植后的免疫排斥反应[2]，相比新生血管，角膜新生淋巴管起着更重要的作用[3]。现在发现血管内皮生长因子C 可以促进淋巴管的增生[4]，增加角膜移植后的复发机率。本实验主要研究抑制血管内皮生长因子C对淋巴管的作用以及对移植角膜后角膜存活率的研究。

1 实验材料

1.1 实验器材和试剂

裂隙灯(泗洪县爱尔医疗器械厂)；RT-PCR检测仪(吉满生物科技有限公司)；荧光倒置相差显微镜(上海仪天科学仪器有限公司)；抗VEGF-C单克隆抗体(上海昕浩生物科技有限公司)。

1.2 实验动物和实验分组

100只BALB/c雄性小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，随机分为3组，每组20只，其余40只备用。按照正常的饮食进行对小鼠的喂养，温度和湿度适宜。分为正常对照组、移植组和封闭血管内皮生长因子C组，移植组和封闭血管内皮生长因子C组中的20只小鼠分别进行角膜移植。

1.3 模型的构造

移植组和封闭血管内皮生长因子C组的20只小鼠，首先采用戊巴比妥钠(0.5%，50mg/kg体重)全身麻醉联合1%盐酸奥布卡因点眼局部麻醉。麻醉后采用最新的角膜移植技术，分别对移植组和封闭血管内皮生长因子C组20只小鼠进行角膜移植。术后如果出现前房穿孔、晶体损伤脱位、虹膜出血粘连等并发症的小鼠，均应该被淘汰，最后每组选取10只研究小鼠，术后按正常的护理营养进行喂养，放置的温度湿度适宜小鼠生存。

2 实验方法

2.1 具体实施

取上述小鼠模型进行实验，3组小鼠中随机挑选10只小鼠，移植组和封闭血管内皮生长因子C组的小鼠从无并发症的移植小鼠中进行选取。在小鼠做完手术后，且无并发症的前提下，正常组、移植组小鼠注射10mL/Kg的生理盐水，封闭血管内皮生长因子C组注射等剂量的抗VEGF-C单克隆抗体，观察实验小鼠的效果。

2.2 数据的收集

正常对照组取两只小鼠，移植组和封闭血管内皮生长因子C组分别在术后第3,7,10,14d分别取两只小鼠进行取材。取小鼠右眼角膜，用甲醛固定24h后做成切片。完成切片制作后，取小鼠左眼的角膜，立即用-4℃丙酮液固定15min，常温下PBS漂洗3次，加入0.3%Triton X-100液常温下15min，5%BSA+山羊血清封闭1h。制作完标本后，使用对应的抗体进行免疫组化。去液、漂洗，注意避光，滴加抗荧光粹灭封片液封片，在荧光倒置相差显微镜下观察拍照。测定VEGF-C的表达使用蛋白匀浆液5ml、苯甲基磺酰(PMSF)15μl、3-巯基乙醇5μl，充分混匀后，用离心机进行离心，1500r/min离心5min，去除上清液。制备好标本后，妥善保存，加入到电泳装置中进行电泳实验，通过观察电泳的实验结果，确定VEGF-C的表达含量。集取小鼠角膜移植成功后的存活率，通过裂隙灯观察小鼠角膜内的浑浊程度，判断角膜有没有移植成功，通过对3组的分别计数可以容易地得到结果。

2.3 统计学分析

采用应用 SPSS21.0 统计软件进行数据的处理。实验数据以均数±标准差表示，组间使用方差分析比较，P<0.05证明数据在统计学上有显著差异。

3 实验结果

3.1 淋巴管的计数

表1说明正常对照组角膜缘有较少的淋巴管，没有发现有新生的淋巴管。根据实验结果表明移植组和封闭血管内皮生长因子C组新生的淋巴管明显高于正常对照组，14d后新生的淋巴管达到高峰。移植组角膜缘发出的新生淋巴管数目比较集中、粗大，封闭血管内皮生长因子C组仅角膜缘生出树枝状粗短新生淋巴管芽，数目少且细小。

正常对照组

移植组

封闭VEGF-C组

表1 术后不同时间点各组角膜切片淋巴管的计数

组别3d7d10d14d正常对照组0000移植组1.35±0.083.01±0.293.27±0.252.89±0.17封闭VEGF-C组0.93±0.11∗2.13±0.17∗2.25±0.34∗1.77±0.21#

注：对比移植组，*P<0.05,#P<0.01。

3.2 VEGF-C的表达

表2说明正常对照组角膜仅有少量的VEGF-C的表达，移植组的VEGF-C的表达显著大于封闭血管内皮生长因子C组。结合表1说明，VEGF-C的表达和角膜新生淋巴管有很大的相关性，封闭血管内皮生长因子C有助于抑制淋巴管的增生。

表2 VEGF-C的表达量

组别正常对照组移植组封闭血管内皮生长因子C组VEGF-C的表达量0.264±0.0780.78±0.0860.282±0.028

注：对比移植组，P<0.05。

3.3 角膜移植存活小鼠计数

表3说明，正常对照组小鼠数量没有变化，移植组的成功率显著小于封闭血管内皮生长因子C组，说明血管内皮生长因子和小鼠的角膜移植存活密切相关。

表3 角膜移植存活小鼠计数(n=10)

组别3d7d10d14d正常对照组0000移植组9887封闭VEGF-C组10101010

注：P<0.05，在统计学上有显著差异。

4 讨论

角膜移植是利用异体的正常透明组织，取代混浊病变的角膜组织，使患眼复明或控制角膜病变[5]。角膜移植的成功率关乎很多盲人的切身利益，国家在有关方面做出了很多研究投入，希望能够及早地降低角膜移植的失败率。研究发现，血管内皮生长因子C、VEGFR-3及VEGF-D系统是一组能够调节淋巴管生成的重要因子[6～7]。国内外研究表明，VEGF-C是已知的主要淋巴管形成生长因子，它通过对新生淋巴管内皮细胞的增殖和迁移的调控[8]，促进淋巴管的形成，从而导致角膜移植的失败。如果抑制血管内皮生长因子C有可能降低角膜失败的机率，本实验是通过抑制VEGF-C因子，通过评比新生的淋巴管以及角膜的透光度来证明血管内皮生长因子C确实能够抑制新生淋巴管和促进同种移植存活的作用。实验表明，封闭血管内皮生长因子C确实能够达到抑制新生淋巴管和促进同种移植存活的作用。但是实验过程中也存在一定的缺陷，由于实验的时间比较短无法观察小鼠长期的移植存活率，以及在实验的过程中使用单克隆抗VEGF-C抗体阻断VEGF-C，不同浓度和剂量的单抗没有做出深刻的研究，不知道到底哪种剂量和浓度抑制角膜的新生淋巴管最适宜，这也是下一步需要解决的问题。目前发现，介导角膜缘生成淋巴管的因子还有很多，比如整合素α9β1，吴静[9]等人在这方面做出了研究，表明整合素α9β1对生成淋巴管有促进作用。角膜移植方面的研究还有很多需要探讨的地方，关于VEGF-C因子如何促进淋巴管的增生以及对新生毛细血管是否有影响均是下步探讨的内容。