7例杜氏肌营养不良检测分析

郭鹏波 葛丽丽 郑州儿童医院儿科医学研究所 （河南 郑州 450018）

内容提要： 目的：探索多重链接探针扩增技术（MLPA）检测在杜氏肌营养不良检测方面的应用价值。方法：对郑州儿童医院2018年3月～2018年8月收治的7例杜氏肌营养病例进行多重链接探针扩增技术（MLPA）+Sanger测序检测。结果：随机挑选7例DMD疑似病例及母亲，通过多重链接探针扩增技术（MLPA）+Sanger测序检测，7例为均阳性或携带者，4例患儿发病年龄为8月～8岁，其中3例患儿为运动障碍来医院就诊。结论：多重链接探针扩增技术（MLPA）检测在杜氏肌营养不良检测方面有重要应用价值，能检测出大部分的患者，但是需要以Sanger测序方法作为补充。

假肥大性肌营养不良（DMD）又称杜氏肌营养不良，位于X染色体短臂Xp21处的DMD基因发生缺失、重复或点突变导致[1]，发病率为1:3500[2]，初期病征3～7岁，像鸭子般摇摇摆摆的步态、腰椎前凸、经常跌倒，从地板上站立和攀登楼梯时出现困难，跌倒时站立困难。随着年龄增长，肌肉病变萎缩越来越严重。到12～13岁时，患者便需倚助轮椅出入。患者的心脏肌肉也会因此病而引起变化，导致心肌病。可能发生心律不正，心脏衰竭等病症。通常到20多岁就会因为心肌、肺肌无力而死亡[3]。目前没有治愈的方法，诊断DMD就变得尤为重要。本文介绍一种多重链接探针扩增技术（MLPA），可以诊断DMD，使用MLPA技术可以同时检测DMD基因所有外显子的缺失重复，约占病因的70～80%。

1. 实验方法

取新鲜或两周内4摄氏度保存的EDTA抗凝全血，用QIAGEN试剂盒提取DNA，再用Nanodrop测量浓度，将DNA稀释到20ng/μL，进行去下步骤的操作（荷兰MRC公司MLPA试剂盒）：（1）取PCR反应管，各加入5μL DNA标本；（2）98˚C变性5min，25˚C冷却；（3）配制探针MIX，往每个反应管内加入3μL的探针MIX ；（4）95˚C变性1min，60˚C杂交过夜（16～20h）；（5）配制连接酶MIX，吹打混匀；PCR仪降至54˚C，每个反应管加入32μL的连接酶MIX，54˚C连接15min，98˚C 5min灭活连接酶，反应体系降至20˚C；（6）配制PCR MIX，吹打混匀；每个反应管加入10μL的PCR MIX；（7）进行35个PCR循环（95˚C 30s—60˚C 30s—72˚C 1min）；72˚C继续延伸20min，15˚C完成扩增；（8）配制毛细管电泳反应液MIX；取PCR管，每管加入9.2μL反应液MIX和0.7μL PCR产物；（9）86˚C变性3min，4˚C迅速冷却；（10）上机。

本试验使用ABI-3500基因分析仪，仪器设置：36cm毛细管：注射电压：1.6 kV；注射时间：15秒；运行电压:15 kV；多聚物：POP4；运行时间30分钟。如果用POP7，运行电压：10 kV；相应增加运行时间。密封注射混合物后，86˚C变性3分钟，4˚C2min迅速冷却。

2. 实验对象

2018年3月～2018年8月来郑州儿童医院就诊的疑似DMD患者：位**，位**之母，靳**，靳**之母，徐**，徐**之母，郭**。见表1。

郭**的MLPA检测结果即非阳性又非阴性，如图1。由于郭**的结果无法判读，我们又采用Sanger测序方法对其进行测序，设计引物序列如表2。

检测出郭**的序列后用Snapgene软件与标准序列比对，发现郭**的DMD基因44号外显子部分区域及上游内含子缺失196个bp，为阳性病例。

表1. 结果

图1. 6例DMD患儿及母亲的MLPA结果

表2. 44号外显子引物

3. 结果讨论

多重连接探针扩增技术（MLPA）于2002年由Schouten等首先报道，是近几年发展起来的一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的新技术。该技术高效、特异，在一次反应中可以检测45个核苷酸序列拷贝数的改变，目前已经应用于多个领域、多种疾病的研究。Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见DNA碱基序列的一种方法。

七位受检者全部是阳性或携带者，这表明DMD不难诊断，有经验的临床医生基本可以通过观察患者的临床表型诊断。

郭**的MLPA结果出现0.4个拷贝是因为探针区域存在部分缺失，改变了模板的序列，影响了探针的结合。DMD是比较经典的大片段基因缺失重复导致疾病，MLPA是检测DMD的首选方法，阳性率达到70%～80%。微小缺失及重复占所有DMD患者的10%～20%。对于有明显DMD临床表型但MLPA结果阴性的患者建议进行测序分析。