麦冬皂苷D通过抑制PI3K/Akt信号通路减轻大气细颗粒物对肺泡上皮细胞的氧化损伤

王莹 唐兴华 孙立燕 张珍珍 丁会

(1吉林大学白求恩第一医院，吉林 长春 130021；2山东大学齐鲁医院；3潍坊市中医院)

随着工业化的发展，大气污染已成为人类健康的一大威胁。目前已知的大气污染物约有100多种，但PM2.5(即空气动力学直径≤2.5 μm的细颗粒物)因其特殊性，已成为人类健康所面临的最大环境风险。研究发现PM2.5暴露可引起活性氧(ROS)产生增多，而ROS导致的氧化应激是PM2.5导致机体损伤的主要机制之一〔1，2〕。PM2.5随呼吸进入肺组织，造成ROS在肺内产生增多，过多的ROS作用于细胞膜引起脂质过氧化，还可以消耗体内抗氧化物质使氧化还原系统失衡，导致组织细胞的氧化损伤，最终引起呼吸系统疾病〔3〕。麦冬皂苷(OP)-D是从麦冬中提取的一种甾体皂苷类化合物〔4〕。前期研究发现OP-D可通过抑制核因子(NF)-κB信通路减轻PM2.5诱导的肺泡上皮细胞炎症反应〔5〕，但OP-D是否可以减轻PM2.5诱导的氧化应激及作用机制尚属未知。本文通过PM2.5诱导小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(MLE-12)建立氧化应激模型，OP-D进行干预，从而检测OP-D对PM2.5所致肺上皮细胞氧化应激反应是否具有抑制作用，并探索其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂 OP-D(含量质量分数≥98%，Biotoppe 公司)，PM2.5，DMEM培养基(Corning 公司)、胎牛血清(FBS，Transgen公司)、二甲基亚砜(DMSO，SIGMA公司)，胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液(PBS)及双抗(Transgen公司)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒及增强型电化学发光试剂(ECL)试剂盒(Thermo 公司)，细胞核蛋白提取试剂盒(SIGMA公司)，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)一抗、p-NF-κBp65一抗、NF-κBp65一抗、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)及辣根过氧化物酶(HRP)-标记羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(ABclonal公司)，丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)和磷酸化(p)-Akt (Abcam公司)，超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)，其他试剂为国产或进口分析纯试剂。

1.2细胞培养 小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(MLE-12)，购于中国科学院上海细胞所。MLE-12细胞用含10% FBS的DMEM培养基，放置于37℃，5%CO2培养箱中培养，取对数期细胞用于实验。

1.3药物配制

1.3.1PM2.5悬浊液 用颗粒采样器采集大气PM2.5于玻璃纤维滤膜(孔径2.5 μm)上，将载有 PM2.5 样品的滤膜剪裁成小片并浸泡在无菌蒸馏水中，超声震荡60 min，无菌纱布过滤、干燥后获得PM2.5 样品，加入无菌PBS配制PM2.5悬浊液。应用前超声震荡灭菌30 min使颗粒物充分混匀。

1.3.2OP-D溶液 用DMSO配成质量浓度为10 mmol/L的原液，实验时再用DMEM培养基稀释至所需浓度(DMSO浓度小于总体积的0.01%)。前期实验发现，OP-D在<80 μmol/L的浓度内对MLE-12细胞活力无明显影响〔5〕。

1.4MDA含量与SOD活性检测 实验分为空白对照组、PM2.5组及OP-D低、中、高浓度(10、20、40 μmol/L)组。MLE-12细胞以2×105个细胞/ml接种于细胞培养皿中，细胞长至70%后，依既定浓度加OP-D于各浓度组中，预处理1 h后，在OP-D组及PM2.5组中分别加入PM2.5混悬液(终浓度80 μg/ml)培养24 h。分别收集各组细胞及细胞培养基上清。硫代巴比妥法检测细胞上清液中MDA含量，操作步骤按照说明书进行。收集各组细胞沉淀后，超声5 s×5次，使细胞破碎得到细胞匀浆，黄嘌呤氧化酶法检测细胞裂解液中SOD 活性。

1.5Western印迹检测 药物处理后收集各组细胞，加入细胞裂解液提取目的蛋白。而后BCA法蛋白定量，加入上样缓冲液煮沸变性 10 min，蛋白样品经十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳、转膜、封闭，一抗 4 ℃ 孵育过夜，二抗室温孵育1 h后，加入ECL显影液显色。化学发光凝胶成像系统下显影成像，Image Lab5.2.1 软件对目的条带进行灰度扫描，以GAPDH为内参。

1.6统计学处理 应用SPSS20.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1OP-D对MDA含量及SOD活性的影响 与空白对照组比较，PM2.5组及OP-D高、中、低剂量组中的MDA含量均明显增高(P<0.05)，SOD 活性均明显降低(P<0.05)。OP-D低、中、高浓度组MDA含量随干预剂量的增加呈一定的下降趋势，SOD活性呈一定上升趋势，且OP-D中、高浓度组MDA含量显著低于PM2.5组，SOD活性显著高于PM2.5组(P<0.05,P<0.01)，见表1。

表1 各组MLE-12细胞培养基上清MDA含量及 SOD活性比较

与空白对照组比较：1)P<0.05;与PM2.5组比较：2)P<0.05，3)P<0.01，表2同

2.2OP-D对PI3K、p-Akt和p-NF-κBp65蛋白表达量的影响 与空白对照组相比，PM2.5组细胞内PI3K、p-Akt和p-NF-κBp65蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。而随OP-D干预剂量的增加，PI3K、p-Akt和NF-κBp65蛋白表达呈浓度依赖性的下降，OP-D高浓度组可使各蛋白表达量显著降低(P<0.01)，但并未恢复至正常水平(P<0.05)。见表2，图1。

表2 各组PI3K、p-Akt、p-NF-κBp65 相对表达量的比较

3 讨 论

PM2.5可以长时间悬浮于空气中，吸附重金属、有机物、细菌病毒等多种有害物质，可经呼吸系统最终进入血液，引起多器官的氧化应激损害。而实验发现，OP-D可阻断NF-κB和胞外调节蛋白激酶(ERK)信号级联反应，抑制过氧化氢(H2O2)诱导的血管内皮细胞的脂质过氧化，进而抑制ROS的产生及氧化酶的活性，并提高细胞抗氧化能力〔6〕。还可通过调节Wnt/β-连环素(catenin)信号通路，抑制氧化应激，使骨细胞功能障碍得到改善〔7〕。OP-D可能具有抑制PM2.5介导的氧化应激的作用，可能具有减轻PM2.5诱导的肺泡上皮细胞氧化应激的作用。

SOD 是细胞内的抗氧化酶，其活性的高低可反映机体抗氧化损伤能力，而MDA是脂质过氧化的产物，二者常用于氧化应激的研究。研究显示〔8〕，PM2.5作用于支气管上皮细胞，能引起 SOD 的表达抑制,而使MDA等的表达增加,导致肺组织的氧化应激损伤。本研究结果显示，PM2.5暴露可明显降低肺泡上皮细胞内 SOD 活性并增加细胞上清液中MDA 含量，这一结论与相关报道一致〔9〕。而中高浓度的OP-D预处理，可拮抗PM2.5诱导的SOD 活性降低及MDA的增加，说明麦冬皂苷D能在一定程度上抑制PM2.5所致的氧化应激损伤。

PM2.5暴露所产生的ROS可激活一些信号通路，如PI3K/Akt，肿瘤相关蛋白53(p53)和NF-κB等，并对细胞产生一系列不利影响〔10，11〕。PI3K/Akt信号通路是一条重要的信号转导通路，在细胞中发挥调节细胞生长、增殖、基因组稳定等多种功能。其中，Akt能够促使活化的NF-κB随后转入细胞核，与启动子和增强子序列位点发生特异性结合，促进目的基因的转录和表达，参与免疫、炎症和应激反应等过程〔12〕。研究发现，PM2.5暴露可通过抑制氧化应激介导的PI3K/Akt信号通路，导致NF-κB抑制蛋白激酶(IKK)-β/NF-κB的持续激活，使气道上皮细胞产生炎症反应〔13〕。本研究结果显示，PM2.5显著上调了PI3K的表达及Akt的磷酸化水平，而OP-D干预可降低细胞内PI3K、p-Akt蛋白的表达，且其抑制作用随浓度增大而更加明显；并且PM2.5诱导的活化NF-κB p65也呈浓度依赖性的降低。据此推测OP-D可能通过抑制PI3K/AKT/ NF-κB信号通路，一定程度上减轻PM2.5 诱导的氧化损伤，从而保护肺泡上皮细胞。本实验结果显示，高剂量的OP-D并未能使PM2.5诱导的氧化应激反应完全被抑制，说明可能存在其他未知通路参与其中，有待进一步深入研究。