雌激素受体-β 基因多态性对广西壮族绝经后妇女血清护骨素的影响

黎飚 李海 陈建海 杨洁 梁倩 方晓燕

(右江民族医学院，广西 百色 533000)

绝经后卵巢功能下降导致雌激素水平降低，从而引起骨质流失加快，引起绝经后骨质疏松(PMOP)，PMOP是老年骨质疏松发病最高、临床症状最重一种。其发病机制与雌激素分泌减少，护骨素水平下降有关〔1～3〕。已有研究证实，雌激素受体(ER)基因多态性与PMOP有关〔4,5〕，但广西壮族绝经妇女ER-β基因多态性与血清护骨素水平未见报道。本文主要了解广西壮族绝经后妇女ER-β基因多态性对其血清护骨素的影响。

1 对象和方法

1.1研究对象 本研究选取祖宗三代均为纯壮族广西绝经妇女667人，并排除肝、心、肺和骨科疾病，近期也未用影响骨代谢激素和其他药品,年龄40～80岁。

1.2骨密度(BMD)检测 采用超声跟骨骨质密度仪(QUS)测量BMD。由同一特训、熟练的骨质密度仪操作人员测定。 酶联免疫吸附试验测定血清护骨素。

1.3ER基因多态性检测

1.3.1引物设计与合成 按照相关文献进行设计引物〔3〕， ER-β基因扩增Rsa I位点：上游引物是：5'-TCTTGCTTTCCCCAGGCTTT-3'，下游引物为：5'-ACCTGTCCAGAACAAGATCT-3'。ER-β基因扩增AluI位点：P1：5'-TTTTTGTCCCCATAGTAACA-3'， P2：5'-AATGAGGGACCACAGCA-3'。

1.3.2提取DNA模板 用碘化钠(NaI)法。取100 μl抗凝全血加入双蒸水无菌100 μl，并摇混匀，加NaI (6 mol/L) 200 μl震荡30 s，再加等体积异戊醇/三氯甲烷(1∶24)震荡30 s，离心分离上清液，在上清液里加异丙醇混(1∶0.6)涡旋混匀， 4℃放置15 min，离心并取沉淀物，再用70%乙醇洗涤沉淀物1次，晾干沉淀物并溶于三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-Hcl)+乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中， DNA提取物用紫外分光光度计定量，放置-20℃低温冰箱待测。

1.3.3PCR扩增 内含10×缓冲液200 μmol/L和脱氧核苷酸(dNTPs)200 μmol/L的反应体系为50 μl，0.4 μmol/L的引物，0.1 μg的模板DNA。把反应体、引物和DNA模板一起置于日本产热循环仪(Bio-Rad型)中，经95℃预变性5 min后加入3 U 的TaqDNA聚合酶。反复32次循环，再94℃变性30 s，61℃退火60 s，再在72℃条件下延伸90 s，最后一次循环后，再经72℃10 min最后延伸。取其10 μl产物经凝胶电泳仪进行电泳，染色(用溴乙啶)后，在紫外灯下检测结果和特异性。

1.3.4酶切扩增物 取限切酶Rsa I 10 U，限切酶AluI 20 U和扩增产物10 μl共置于37℃酶切3 h。反应最终产物经过2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙啶染色30 min，DNA分子量标志参照物为参考，电泳结果在紫外灯下观察。

1.4统计学处理 应用SSPS18.0软件进行t检验，例数用直接计数法。

2 结 果

2.1ER-β 基因型分析 ER基因多态性:使用Rsa I酶切可区分出3 种基因型：Rr 型(158 bp，126 bp大小的2条带)；RR 型(126 bp大小的1条带)，rr 型(158 bp大小的1条带)。见图1。使用Alu I酶进行酶切可以区分出3 种基因型：aa型(310 bp大小的1条带)，Aa 型(310 bp，236 bp，68 bp 大小的3条带)，AA 型(238 bp，68 bp大小的 2条带)。见图2。

M:标志参照物；1:Rr 基因型；2:RR 基因型；3:rr 基因型图1 ER-β基因Rsa I多态性电泳图

M:标志参照物；1:aa基因型；2:Aa 基因型；3:AA 基因型图2 ER-β基因Alu I酶切多态性电泳图

2.2ER-β基因Rsa I多态性与跟骨超声BMD测定结果 广西壮族绝经妇女各个ER-β 基因Rsa I 酶切基因组的右跟骨BMD随着年龄增大逐渐减小，60岁之前的ER-β 基因Rsa I 酶切基因5个基因(RR,Rr,rr ，r,R),各个年龄组的BMD差异无统计学意义(P>0.05)，而60岁之后的ER-β 基因Rsa I 酶切基因的r基因与同年龄组其他4个基因(RR,Rr,rr，R)组比较， BMD明显降低(P<0.05)，见表1。

2.3ER-β基因RasⅠ多态性与血清护骨素测定结果 广西壮族绝经妇女各个ER-β 基因Rsa I 酶切基因组的血清护骨素水平60岁后随着年龄增大护骨素水平逐渐减小，60岁之前的ER-β 基因Alu I酶切基因5个基因(RR,Rr,rr，r,R)同年龄组的血清护骨素水平差异无统计学意义(P>0.05)，而60岁之后的ER-β 基因Rsa I 酶切基因的r基因与同年龄组其他4个基因组(RR,Rr,rr，r,R)比较，血清护骨素水平明显降低(P<0.05)，见表2。

2.4ER-β 基因Alu I 多态性与跟骨超声BMD测定结果 广西壮族绝经妇女各个ER-β 基因Alu I 酶切基因组的右跟骨BMD 45岁后随着年龄增大BMD逐渐减小，65岁之前的ER-β 基因Alu I 酶切基因5个基因(AA,Aa,aa，a,A),各个年龄组的BMD差异无统计学意义(P>0.05)，而65岁之后的ER-β 基因Alu I 酶切基因的aa基因与同年龄组其他4个基因组(AA,Aa,a,A)比较， BMD明显提高(P<0.05)，见表3。

表1 ER-β基因Rsa I多态性与不同年龄段BMD测定结果

与r基因型比较：1)P<0.05；表2同

表2 ER-β基因Rsa I多态性与不同年龄段护骨素测定结果

表3 ER-β基因Alu I多态性与不同年龄段跟骨超声BMD测定结果

与aa基因型比较：1)P<0.05；表4同

2.5ER-β 基因Alu I 多态性与血清护骨素测定结果 广西壮族绝经妇女各个ER-β 基因Alu I 酶切基因组血清护骨素55岁后随着年龄增大逐渐减小，65岁之前ER-β 基因Alu I 酶切基因,5个基因(AA,Aa,aa，a,A),各个年龄组护骨素差异无统计学意义(P>0.05)，而65岁之后ER-β 基因Alu I酶切基因的aa基因与同年龄组其他4个基因组(AA,Aa,a,A)比较， 护骨素明显提高(P<0.05)，见表4。

表4 ER-β 基因Alu I 多态性与不同年龄段护骨素测定结果

3 讨 论

临床流行病学研究表明骨质疏松与遗传密切相关〔6,7〕，研究已发现ER-β 基因多态性与绝经妇女血清雌二醇水平有关〔8〕。研究表明雌激素增加破骨细胞的溶骨功能，抑制成骨细胞成骨功能，导致骨质流失增加〔9,10〕。雌激素是通过与ER结合发挥其生理效应的，自然ER基因多态性会影响绝经妇女的BMD，所以ER基因多态性与PMOP密切相关〔11〕。护骨素与核因子-κB 受体活化因子(RANK)配体结合阻断破骨细胞激活信息通道：核因子-κB 受体活化因子与RANK配体(RANKL)的结合，从而抑制溶骨，拮抗骨质疏松〔12〕。本研究结果说明ER-β的Rsa I各个 酶切基因对绝经妇女早期的护骨素和BMD没有明显影响，而绝经晚期ER-β的Rsa I酶切的r等位基因绝经妇女的护骨素水平下降，破骨细胞功能亢进，导致骨质流失加快，BMD降低。ER-β的Rsa I酶切的r等位基因的广西壮族绝经妇女更易患PMOP，应该提前做好骨质疏松防治。ER-β 的Alu I 酶切基因对绝经妇女早期的护骨素没有明显影响，而绝经晚期ER-β 的Alu I 酶切的aa等位基因妇女的护骨素水平提高，破骨细胞功能被抑制，成骨功能强于破骨功能，BMD得以提高。aa等位基因广西壮族绝经妇女不易患PMOP。

综上，对引起绝经妇女护骨素和BMD下降的易患PMOP的ER-β基因人群提前做好防治工作，可以减少PMOP发病，可以大大减轻社会和家庭经济负担。