探究式深入学习：促进生物学本科生在质粒DNA提取实验中练就基本能力

李红民 步怀宇 徐敏 余源 陈富林

[摘 要]“质粒DNA提取”是生物学本科生必修专业课分子生物学实验的基本内容。为提高教学效果，教师以实验现象和结果作为切入点，引导学生解释现象、分析结果，启发学生对实验结果进行分析与讨论，并对讨论结果进行小结。实践证明，在实验课教学中，启发学生运用理论知识解释实验现象、独立分析实验结果并与其他结果进行比较分析，能够在锻炼与提高学生独立操作技能的同时，最大限度地发挥学生的学习主体作用；把简单的实验学习转变为仔细观察、独立思考、多向思维、发现问题、解决问题、深入学习等基本能力的潜移默化式培养，及日积月累的训练，非常有利于高素质科研人才的培养。

[关键词]探究式深入学习；质粒DNA提取；分子生物学实验；基本能力

[中图分类号] G642.423 [文献标识码] A [文章编号] 2095-3437（2019）01-0081-03

分子生物学方法与技术对于现代生命科学和基础医学研究的支撑作用使其在生物学专业人才培养中占据重要地位。如何使分子生物学实验教学更好地服务于高素质人才培养，是分子生物学基础理论与实验教学的核心问题[1]。分子生物学实践性很强，其理论形成、发展及其方法技术在生命科学与基础医学研究领域的应用依赖于能够揭示细胞/机体中各种分子机制的实验技术与方法。因此，分子生物学实验技能的掌握程度是衡量生物学本科生培养质量的重要指标。本文以分子生物学常规实验——质粒DNA提取实验为例，介绍如何在生物学实验中引导学生深入学习，提高学习效果，促进学生于实验中练就基本能力。

一、实验内容、环节与实施

“质粒DNA提取实验”是面向本科生开设的最基本的分子生物学常规实验。实验内容由质粒DNA提取基本原理的学习、基本操作实践、琼脂糖凝胶电泳检测以及对检测结果的分析等几个部分构成。上述内容通过教师讲授、学生独立实验、即时操作指导（教师完成）、探究式深入学习等教学环节完成。

（一）实验原理讲授

“质粒DNA提取实验”的教学，通常由教师讲解碱裂解法小量制备质粒DNA的基本原理，帮助学生了解碱性条件下，表面活性剂（如十二烷基磺酸钠，SDS）能够有效使细菌膜蛋白变性而导致细菌质膜结构破坏，存在于细菌染色体之外的质粒DNA在细胞破碎时伴随细胞质外流进入细胞裂解液中并在碱性条件下变性，向裂解液中加入高盐、低pH值的酸性溶液时，会沉淀大部分的蛋白质、脂类、多糖等杂质，通过离心操作去除沉淀和细胞残片后，可进一步利用苯酚、氯仿等有机溶剂去除蛋白类杂质，再通过醇沉淀或者层析的方法从离心上清液中分离出质粒DNA。具有不同空间构象的同种质粒DNA分子在琼脂糖凝胶上电泳时，迁移速率不同。超螺旋结构的分子迁移速率最快，距离点样孔最远，开环结构的分子迁移速率较慢，双链断裂的线状分子的迁移速率介于超螺旋结构的分子和开环结构的分子之间，而且，只有线状分子才可以利用DNA 分子量标准对照品（marker）进行DNA片段大小的推算。

（二）学生独立实验

质粒DNA提取实验的主要操作有：含质粒细菌（过夜培养物）的离心收集、添加溶液Ⅰ重悬菌体、添加含有SDS和NaOH的溶液Ⅱ裂解细菌、添加以乙酸和乙酸钾为主要成分的溶液Ⅲ用以中和溶液II的碱性、去除杂质、电泳及紫外检测等。操作过程中，由教师不断巡视、检查每个学生的基本操作，督促学生仔细观察实验现象并认真记录。选择操作比较熟练的学生制备琼脂糖凝胶备用。获得质粒DNA样品后，迅速移取一定体积的质粒DNA样品至点样孔中，开始电泳。

（三）探究式深入学习

碱裂解法提取质粒DNA的操作比较简单，每个步骤之间没有等待时间，学生完成整个提取操作的时间在40～60 min，而电泳时间为40～60 min。等待电泳结果的过程中，由教师组织学生开展探究式深入学习。探究式深入学习中讨论的问题涉及实验的各部分内容。

围绕实验原理，引导学生思考讨论：质粒DNA是如何复制的？质粒DNA在宿主细胞中的拷贝数对质粒DNA提取有无影响？碱性裂解液中，质粒DNA和基因组DNA会不会变性？加入中和剂后，质粒DNA和基因组DNA的结构会产生什么变化，有无不同？学习了质粒DNA提取，能否独立开展RNA提取、基因组DNA提取实验，有无操作、原理上的差异？为什么要提取质粒DNA，有什么用途？

围绕实验操作与观察，引导学生思考分析：加入溶液Ⅱ之前，为什么要彻底重悬菌体？加入溶液Ⅱ后的现象及其出现的原理是什么？该步骤操作不当会产生什么样的后果？对随后的酶学操作有无影响？电泳时电泳条带会发生什么变化？加入溶液Ⅲ后的现象及其出现的原理是什么？该步骤操作不当会产生什么样的后果？

二、探究式深入学习的开展

本科生学习分子生物学实验后，对质粒DNA提取实验的普遍认知为“质粒是细菌染色体外的一种遗传因子”“做过质粒DNA实验”“质粒DNA电泳会出现超螺旋、线状和开环三种条带，且其迁移速率为‘超螺旋>线状>开环”，其他方面的认知则比较模糊。该现象在我院来自各地的相关专业硕士研究生中较为普遍。在质粒DNA提取实验中围绕实验原理及实验操作开展探究式深入学习，利用多个问题开拓学生思维、延展学生知识面，能帮助学生在掌握一般性实验技能和相关知识的基础上，深入学习了解更多关于质粒DNA的知识。

（一）围绕实验原理的探究式深入学习

该部分的探究式深入学习，不仅可以帮助学生掌握碱裂解法小量制备质粒DNA的方法原理，还能够让学生了解到质粒广泛存在于细菌中，而在真核细胞中鲜有。质粒DNA是共价闭合环状分子，其复制机理与细菌染色体类似，但是复制的调控方式不同。根据质粒在宿主细胞中的复制调控结果，质粒可以分为松弛型质粒和严谨型质粒。松弛型质粒在宿主细胞中的拷贝数可高达数百拷贝，而严谨型質粒在宿主细胞中的拷贝数很低，即使采用相应手段处理，其拷贝数也仅在有限范围内增加。该差别提示学生在选择表达载体、克隆载体时，应尽可能地选择拷贝数较高的松弛型质粒，以增加宿主细胞中目的基因的拷贝数，同时减少制备质粒DNA的工作量。

关于碱裂解法的探究式深入学习，能够让学生牢固掌握其原理，即在碱性条件下利用表面活性剂破坏细菌膜蛋白，导致细胞质外流而成为裂解液。并能提示学生，除了实验中常用的表面活性剂SDS以外，还可以选择其他表面活性剂破坏细胞质膜，但是由于表面活性剂本身性质的差异，当其被用于细胞质膜裂解时，作用浓度、pH值、离子条件、作用时间等可能不同。提取质粒DNA的裂解液由NaOH提供碱性条件，该环境下质粒DNA会变性，基因组DNA同样会变性。但是，基因组DNA与染色体装配蛋白结合在一起，在质粒DNA提取条件下通常不会与染色体装配蛋白完全解离。加入溶液Ⅲ后，迅速中和溶液Ⅱ带来的碱性，已经变性的质粒DNA会恢复双链结构。同时，溶液Ⅲ中的K+很容易与SDS-蛋白质复合物结合，促使变性的蛋白质形成大量白色絮状沉淀，离心操作即可去除蛋白质沉淀以及细胞壁、细胞膜残片。去除沉淀的裂解液上清中既包含质粒DNA分子，又包含蛋白质、脂类物质以及多糖。可以采用醇沉淀的方法从裂解液上清中沉淀析出质粒DNA，或者采用DNA高亲和性层析柱（比如市售各种质粒DNA提取试剂盒）从其中分离出质粒DNA。

在透彻理解质粒DNA提取原理的基础上，引导学生思考RNA提取、基因组DNA提取与质粒DNA提取在原理与操作上有何异同，使学生了解到，无论是质粒DNA提取还是基因组DNA或是RNA的提取，其核心原理都是相同的，即破碎细胞或者组织，去除细胞或组织残片，从裂解液中分离核酸分子。破碎细胞或组织的方法可以采用包括碱裂解法在内的化学法，也可以采用超声破碎法或酶解法。可根据核酸分子的结构、稳定性以及细胞类型和组织种类选择相应的提取方法。

（二）围绕实验操作的探究式深入学习

培养独立操作能力、观察能力、发现问题的能力、解决问题的能力等，是面向本科生开设实验课的宗旨和根本目的。对此，在实验操作过程中，教师应督促学生认真操作，仔细观察，并引导学生围绕实验操作与观察开展探究式深入学习，探讨实验核心问题，进而明晰之所以要在加入溶液II之前彻底重悬菌体，是为了防止菌块的存在，否则一旦加入溶液II，细菌破碎作用开始，菌块表面就会很快因为表面细胞破碎、细胞质外流而变得黏稠，影响裂解液作用于菌块内部的细菌细胞，最终导致裂解不彻底，降低质粒DNA的获得率。

在探讨了解溶液II作用机理的基础上，学生可以很好地运用理论知识解释加入溶液II之后液体变黏稠的实验现象。对“加入溶液II后需彻底混匀且避免剧烈震荡、室温作用时间不超过5min”的深入讨论，能够让学生了解到，彻底混匀是为了充分裂解，而避免剧烈震荡是因为溶液II的碱性会使质粒DNA变性，剧烈震荡可能会使部分单链分子超缠绕，这些超缠绕的单链分子在加入溶液Ⅲ中和碱性后很难与原有的互补单链恢复双链结构，而以超缠绕状态存在于裂解液中，电泳时，其迁移速率远大于超螺旋双链质粒DNA分子（鼓励学生简单作图示意）。另外，剧烈震荡还可能产生更多类型开环状态的双链质粒DNA分子，这部分分子的电泳迁移速率明显慢于正常的开环分子（鼓励学生简单作图示意）。还可以启发学生结合限制性内切酶的作用特点，推断出这部分单链分子不能够被限制性内切酶作用。而对于溶液II作用时间的讨论，可以让学生了解到，过长的作用会导致染色体装配蛋白与基因组解离而释放出基因组，由于基因组分子量很大，最终获得的DNA以基因组DNA为主而导致质粒提取失败。

加入溶液Ⅲ与加入溶液II的操作类似，加入溶液Ⅲ以后，同样要求轻缓的彻底颠倒混匀。经过探讨，可以帮助学生了解，该步彻底混匀主要是为了充分中和溶液Ⅱ的碱性，最大限度地允许变性的质粒DNA分子恢复双螺旋结构，同时尽可能去除SDS-蛋白质复合物。而避免剧烈震荡主要是防止超缠绕质粒DNA分子的出现，这种结构很难被相应的酶所作用。

三、探究式深入学习的效果

（一）培养了学生学以致用的能力

学以致用是学习知识的终极目标之一，是观察、发现、思考、分析、理论联系实际等能力的综合体现。实验课堂是培养、锻炼学生多方面能力的场所，也是考量学生学以致用能力的最佳场所。实验的目的是学习操作技能与方法，但更重要的是学习怎样在实验中收集数据、分析数据、从实验数据中推出实验结论，即学以致用能力的培养。

“質粒DNA提取”是一个经典的融操作、观察、分析等能力培养于一体的实验案例，有利于培养学生多方面能力。提取质粒DNA完成之后，通常都会采用琼脂糖凝胶快速检测提取效果，帮助学生直观了解质粒DNA构象不同对迁移速率的影响。由于每个学生操作上的差异，制备的质粒DNA分子的结构状态通常不同。有的样品只能检测到超螺旋结构的存在，有的以超螺旋结构为主同时包含少量线状分子，有的以超螺旋为主同时包含开环结构和线状结构，有的除了经典的超螺旋结构、线状结构和开环结构外，还出现一两条较开环状态迁移速率更慢的结构类型。电泳等待过程中的探究式深入学习中，在教师的启发下，多数学生能够联系到溶液II的作用与加入时的注意事项，较好地分析自己和他人的实验结果，并对条带差异进行解释。学生能从只关心“实验结果对不对”“老师说……”“我做对了”的学习习惯逐渐向“我观察到的现象是怎么回事，为什么会出现这种现象？”“我的结果是否正常，为什么不正常或正常？”“我的操作对不对，不对会产生什么影响？”等充满思考与探究的学习方式转变，发挥了学生的学习主体性和能动性。经过长时间的潜移默化式培养，学生的学以致用能力不断得到提高。

（二）提升了学生仔细观察的能力

观察能力是各个学科人才必须具备的基本能力，也是发现新问题、新事物的必备能力。虽然观察能力的培养，既不要求苛刻的智商条件，也不要求有大量的精力和时间，但是在本科生实验中却极易被忽略。真正的科学大家往往具有敏锐的观察力和对观察结果的强烈好奇心，这是开始有效探究的前提和基础。天生具有敏锐观察力的人并不是很多。在本科生培养中，观察能力的培养，可以看成是观察习惯的培养。“质粒DNA提取实验”是一个能够有效培养学生观察习惯的典型实验。几步关键实验操作均伴随着明显的反应变化，督促学生仔细观察并自行思考实验现象出现的原因，不仅能培养学生的观察习惯，且无形中强化了学生的思维能力和学以致用的能力。仔细观察能力/习惯的形成，有利于学生在工作实践中发现问题、发现新的事物，乃至形成原创性的科学问题。

（三）培养了主动深入学习的能力

生活水平的提高，在一定程度上削弱和打击了现代大学生自我拼搏、奋发向上的动力和积极性。如何提高大学生的学习积极性，既是思想教育工作者的难题，也是课程讲授教师的难题。彻底解决该难题的关键在于，充分调动学生的学习积极性，而不是一味地追求教学方法、教学手段的改革与创新。探究式教学对于调动学生的学习积极性卓有成效，但仅适合小班化教学。对于人数较少的实验班（15～24人）则较为合适。开展探究式深入学习，可在探究讨论的过程中开拓学生思维、拓展学生的知识面，于无形中调动学生的学习积极性，同时让学生体会到，只要主动深入学习，也能从简单实验中获得大量的知识及提高自身的基本能力。

四、小结

探究式教学法因与以创新培养为核心的国际教育发展趋势和国内学生素质教育贴合度较高，自20世纪90年代引入我国后，国内高等教育研究者就探究式教学法的优缺点、意义、实施策略等展开了大量理论层面的研究与探讨[2]。但在具体教学过程中实践探究式教学和探究式学习的案例却鲜少报道。

“质粒DNA提取实验”只是分子生物学实验中相对简单的一个实验，相对于理科各学科而言，更是沧海一粟。与其他理科实验一样，质粒DNA提取实验可以很好地锻炼本科生的基本操作技能（如移液器的使用、微量离心机的使用等）和基本能力（如仔细观察的能力、思考能力、分析能力等）。在引入探究式深入學习的“质粒DNA提取实验”教学案例中，避开了“要学会自己分析”“要独立思考”等常规的教学要求，由教师围绕实验现象适时地提醒学生仔细观察，自己琢磨现象出现的原因，这既要求学生能透彻理解实验原理，又要求学生具备较强的独立思考与分析能力。在透彻理解实验原理、回顾核酸理化性质等理论知识的基础上，引导学生分析操作不当可能产生的后果，并将探究结果用于分析自己的实验结果与他人实验结果的异同，不仅让学生理解了为什么实验操作有“注意事项”，同时也增强了学生辨识不同实验结果的能力。笔者相信，将这样的训练贯穿在所有本科生的实验操作当中，会使本科生的各项能力得到稳步提高，而且既有利于提高本科生培养质量的平均水平，也有利于选拔真正的创新拔尖人才（具有敏锐的观察力、敏捷的思维、强大的知识接受能力和自我拓展学习的能力、逻辑思维能力等的人才）。而对每一个学生而言，在自然科学实验中培养出的观察、思考、分析、发现、解决问题等基本能力，也将有助于他们融入社会生活或者转而从事社会科学相关工作。

[[ 参 考 文 献 ]]

[1] 杨建雄.分子生物学[M] . 2版.北京：科学出版社，2015.

[2] 邢大伟.探究式教学法的应用实践与探索[J].教育教学论坛，2014（4）： 207-208.

[责任编辑：黄春香]