利用均匀设计法优化鸡母种培养基*

袁征超，薛玲娜，苏楚亮，杨昱仪，卢 意，莫美华

（华南农业大学食品学院，广东 广州 510642）

1 材料与方法

1.1 供试菌种

1.2 PDA培养基制备

选取马铃薯200 g，洗净去皮切碎，加水1 000 mL煮沸30 min，纱布过滤，再加15 g葡萄糖和20 g琼脂，充分溶解后于121℃灭菌20 min，取出冷却后贮存备用。

1.3 菌种活化

1.4 均匀设计试验法

1.4.1 可溶性碳酸钙清液制备

称取10 g可溶性轻质碳酸钙，溶于1 L水中，搅拌溶解静置10 min后，取上层清液，添加相应量到相应的试验组中。

1.4.2 蚁穴浸提物的制备

1.4.3 均匀设计试验

（1）均匀设计试验方案的制定

根据单因素试验结果，选取对鸡枞菌丝生长较好的碳源、氮源、氨基酸、维生素、无机盐、蚁穴物、抑菌剂，如马铃薯汁、麦芽糖、酵母膏、VB9、脯氨酸、碳酸钙清液、磷酸二氢钾、硫酸镁、蚁穴浸提物、链霉素10个因素作为均匀设计的参试因子，每因子设12个水平，见表1[8-9]，采用10因素12水平的均匀设计表U1（2121）0进行试验设计，见表2，得出鸡菌母种培养基优化方案，见表3。按照表3的试验方案配制母种培养基，在121℃灭菌30 min，倒于平板，冷却凝固后，接入准备好的菌种圆片，倒置于26℃恒温生化培养箱中避光培养。

（2）各组分的添加方式

马铃薯汁、麦芽糖、酵母膏、可溶性碳酸钙清液、磷酸二氢钾、硫酸镁、蚁穴浸提物配成母种培养基的主液，121℃高压蒸汽灭菌30 min；VB9、脯氨酸、链霉素3种热敏性的组分通过滤径为0.22μm无菌脂溶性滤膜过滤后，添加到培养基主液中。

表1 参试因子水平表Tab.1 List with regard to all relative parameters

试验号 列号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 2 3 4 5 6 8 9 10 12 2 2 4 6 8 10 12 3 5 7 11 3 9 12 2 5 11 1 4 10 4 4 8 12 3 7 11 6 10 1 9 3 6 5 5 10 2 7 12 4 1 6 11 8 6 6 12 5 11 4 10 9 2 8 7 7 7 1 8 2 9 3 4 11 5 6 8 3 11 6 1 9 12 7 2 5 9 9 5 1 10 6 2 7 3 12 4 8 10 10 7 4 1 11 8 2 12 9 3 11 11 9 7 5 3 1 10 8 6 2 12 12 11 10 9 8 7 5 4 3 1

试验组X2X3X4X5X6X7X8X9X10/（mg·L-1）1 0 2.0 1.0 60.0 80.0 5.0 7.0 8.0 180.0 22.0 2 20.0 6.0 2.5 140.0 180.0 11.0 2.0 4.0 120.0 20.0 3 40.0 10.0 4.0 220.0 20.0 4.0 10.0 0.0 60.0 18.0 4 60.0 14.0 5.5 40.0 120.0 10.0 5.0 9.0 0 16.0 5 80.0 18.0 0.5 120.0 220.0 3.0 0.0 5.0 200.0 14.0 6 100.0 22.0 2.0 200.0 60.0 9.0 8.0 1.0 140.0 12.0 7 120.0 0 3.5 20.0 100.0 2.0 3.0 10.0 80.0 10.0 8 140.0 4.0 5.0 100.0 0 8.0 11.0 6.0 20.0 8.0 9 160.0 8.0 0 180.0 100.0 1.0 6.0 2.0 220.0 6.0 10 180.0 12.0 1.5 0 200.0 7.0 1.0 11.0 160.0 4.0 11 200.0 16.0 3.0 80.0 40.0 0 9.0 7.0 100.0 2.0 12 220.0 20.0 4.5 160.0 140.0 6.0 4.0 3.0 40.0 0各参试因子用量X1/（mL·L-1）/（g·L-1）/（g·L-1）/（μg·L-1）/（μg·L-1）/（mL·L-1）/（g·L-1）/（g·L-1）/（mL·L-1）

（3） 接种培养

在超净工作台的无菌环境下，将制备好的直径为0.35 cm的鸡菌菌种圆片，接入到相应的培养基平板中。将接种好的平板倒置，于26℃恒温生化培养箱中避光培养。

1.5 数据统计与分析方法

所有实验均设3个重复，采用DPSv9.5数据处理软件进行数据分析和数据处理。采用Duncan新复极差法进行多重比较。对均匀设计的试验结果使用二次多项式回归分析方法，然后通过数学模型模拟获得最优配方。

2 结果与分析

2.1 均匀设计试验优化结果

均匀设计试验结果见表4。

试验结果的指标为菌丝生长速度、菌丝洁白度和菌丝密度[10]。以菌丝生长速度为目标函数（Y），用DPSv9.5对数据进行二次多项式逐步回归分析，所得回归方程为：

表4 鸡菌母种培养基优化均匀设计试验结果Tab.4 Results of the experiments above by using orthogonal devices

表4 鸡菌母种培养基优化均匀设计试验结果Tab.4 Results of the experiments above by using orthogonal devices

注：“*”越多说明菌丝越洁白；“＋”越多说明菌丝生长密度越浓厚。Notes：The more*means more dense mass of mycelia，the more＋means more witness mass of mycelia.

试验组 生长速度/（mm·d-1） 洁白度 菌丝密度11 1.4095±0.0244a *** ＋＋＋10 1.2548±0.0206b **** ＋＋＋＋5 1.2452±0.0012bc *** ＋＋＋6 1.2131±0.0239bcd ** ＋＋12 1.2071±0.0126bcd ** ＋＋9 1.1952±0.0131cd **** ＋＋＋＋2 1.1857±0.0186d * ＋4 1.1690±0.0160d ** ＋＋＋3 1.1048±0.0131e ** ＋＋7 1.0524±0.0113f ** ＋8 0.9583±0.0131g * ＋＋1 0.9048±0.0121h * ＋

对回归方程进行检验，得到复相关系数R=0.999977，由此可见，菌丝生长速度与回归方程中试验因素的含量有密切的相关性，其显著性检验值F值=4 752.0164，显著水平P值=0.0002＜0.01，剩余标准差SSE=0.0022，调整相关系数Ra=0.999871，回归方程极显著，说明方程的可信度高。

方程中各项试验因子的回归系数和t检验结果见表5。

表5 各回归项的回归系数检验Tab.5 Regression coefficient test of each regression item

由表5可知，方程中有X1（马铃薯汁） 与X2（麦芽糖）、X1（马铃薯汁） 与X7（磷酸二氢钾）、X2（麦芽糖） 与X6（碳酸钙清液）、X4（VB）9与X8（硫酸镁）、X6（碳酸钙清液） 与X7（磷酸二氢钾） 共5组的交互作用显著水平小于0.01，说明马铃薯汁和麦芽糖、马铃薯汁和磷酸二氢钾、麦芽糖和碳酸钙清液、VB9和硫酸镁、碳酸钙清液和磷酸二氢钾等的交互作用对菌丝生长速度影响很大，达到极显著水平。麦芽糖、碳酸钙清液对鸡菌菌丝的生长达到显著水平。鸡菌母种培养基优化均匀设计试验结果见图1。

图1 鸡菌母种培养基优化均匀设计试验结果Fig.1 Results of the optimum uniform design of stock culture medium of Termitomyces spp.

结合图1和表4可以看出，得出试验组11的菌丝生长速度最快，该条件对菌丝的促生长作用效果明显，同时菌丝洁白度和菌丝密度两个指标的相对值也较好，该组直观表现最优；而试验组10和试验组9中，菌丝洁白度和菌丝密度两指标明显，但试验组9的菌丝生长速度较试验组10要慢，因此若针对菌丝洁白度和菌丝密度的高效培养，可以选择试验组10。样本的观察值、拟合值和拟合误差见表6。

根据表6数据显示，观察值与拟合值接近，最大拟合误差绝对值仅为0.0018，进一步说明了回归方程的准确性。

2.2 均匀设计试验结果的验证

通过DPSv9.50进行回归分析，并通过数学模型模拟得到鸡母种培养基的理论最优组合如表7所示，将其与组间最优配方11、配方10和真菌通用培养基PDA进行对比培养的验证实验，结果如表8所示。

结合表8和图2可知，在理论最优配方和配方11的培养基中，鸡菌丝生长速度最快，且两者差异不显著，配方10与配方11相比菌丝的生长速度差异也不显著，在PDA上的生长速度最慢，且与其他配方存在显著差异（P＜0.05）。因此，鸡菌菌丝生长最快的母种培养基理论最优组，具体配方为马铃薯汁 126.20 mL·L-1、麦芽糖 11.63 g·L-1、酵母膏5.50 g·L-1、VB947.90 μg·L-1、脯氨酸 23.37 μg·L-1、可溶性碳酸钙清液0、磷酸二氢钾0.07 g·L-1、硫酸镁 4.19 g·L-1、蚁穴浸提物 61.82 mL·L-1、链霉素2.33 mg·L-1。

表6 试验组的观察值、拟合值和拟合误差Tab.6 Observed value，fitted value and fitted error of the samples

2.3培养基中硫酸镁（X） 8与生长速度关系

培养基中硫酸镁（X）8与生长速度关系见图3。

表7 验证试验的培养基Tab.7 The medium of the control experiments

表8 验证试验的结果Tab.8 Results of the control experiments

图2 鸡菌培养基的对照试验结果Fig.2 Results of the control experiments of medium of Termitomyces spp.

3 结论

图3硫酸镁（X8）与生长速度关系Fig.3 Effect of magnesium sulfate （X8） on the mycelial growth rate

从均匀设计优化结果可以看出理论最优配方和配方11的生长速度最快，两者间无显著差异（P＜0.05），两者的菌丝洁白度、菌丝密度间也无显著差异；虽然配方10的生长速度比理论最优配方慢，且两者间差异显著，但是配方10的菌丝洁白度、菌丝密度均优于理论最优配方和配方11。因此确定鸡菌母种培养基生长速度最优配方为：马铃薯汁 126.20 mL·L-1、麦芽糖 11.63 g·L-1、酵母膏 5.50 g·L-1、VB947.90 μg·L-1、脯氨酸 23.37 μg·L-1、可溶性碳酸钙清液0、磷酸二氢钾0.07 g·L-1、硫酸镁4.19 g·L-1、蚁穴浸提物 61.82 mL·L-1、链霉素 2.33 mg·L-1。菌丝生长最浓密的配方为：马铃薯汁180.00 mL·L-1、麦芽糖 12.00 g·L-1、酵母膏 1.50 g·L-1、VB90、脯氨酸200.00μg·L-1、可溶性碳酸钙清液7.00 mL·L-1、磷酸二氢钾 1.00 g·L-1、硫酸镁 11.00 g·L-1、蚁穴浸提物 160.00 mL·L-1、链霉素 4.00 mg·L-1。