丹参酮ⅡA磺酸钠有关物质纯化与结构鉴定

董莹 丁金国 黄臻辉

摘 要 目的：对丹参酮ⅡA磺酸钠原料生产工艺中的主要有关物质进行纯化和结构鉴定。方法：采用制备高效液相色谱法，对其有关物质进行富集和分离纯化，最终获得HPLC纯度>98%的目标组分。冷冻干燥后，分别进行MS和NMR分析及结构鉴定和解析。结果与结论：鉴定得到三种有关物质，结构确证为丹参酮ⅡB磺酸钠、丹参酮Ⅰ磺酸钠、紫丹参甲素磺酸钠。这为丹参酮ⅡA磺酸钠原料药及制剂的质量控制、标准提高和稳定性研究提供对照品及依据。

关键词 丹参酮ⅡA磺酸钠 有关物质 分离纯化 结构鉴定

中图分类号：R917； R286 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2019）01-0070-04

Isolation and structure identification of sodium tanshinoneⅡA sulfonate

DONG Ying*， DING Jinguo， HUANG Zhenhui**

（Shanghai NO.1 Biochemical and Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200240， China）

ABSTRACT Objective： The purification and structure identification of the related substances remained in production process of the raw material of sodium tanshinoneⅡA sulfonate were performed. Methods： The related substances with HPLC purity over 98% were obtained by preparative HPLC after they were enriched， isolated and purified. After freeze-drying process， these substances were analyzed by MS and NMR and their structures were identified and elucidated. Results & Conclusion： Three related substances were obtained and confirmed as sodium tanshinoneⅡB sulfonate， sodium tanshinoneⅠ sulfonate and sodium przewaquinone sulfonate， respectively， which were provided reference samples and scientific basis for the quality control， standard improvement and stability study of the raw material and preparations of sodium tanshinoneⅡA sulfonate.

KEy WORDS sodium tanshinone ⅡA sulfonate； relative substances； isolation and purification； structure identification

丹參为唇形科鼠尾草属植物，其根入药，化学成分含脂溶性的二萜醌类和水溶性的酚酸类。丹参酮ⅡA磺酸钠（sodium tanshinoneⅡA sulfonate，STS）是二萜醌类化合物丹参酮ⅡA经磺化而得到的水溶性磺酸盐。临床数据和药理学研究表明，由于其具有抗氧化活性、减少血栓形成、能够降低缺血再灌注所产生的心肌线粒体脂质体过氧化物的含量、改善心肌线粒体膜的流动性、促进旁系血管再生及有效增加冠状动脉流量，对冠心病心绞痛及胸闷、心肌梗死、室性早搏等有显著疗效[1-4]，其注射剂已在临床上广泛使用。

Wang等[5]从STS原料中通过色谱分离纯化、LC- MSn和NMR鉴定推测出8种有关物质；Zou等[6]从STS原料中通过色谱分离纯化、UV、LC-MS和NMR鉴定推测出6种有关物质。而其磺化过程中的副产物和杂质成分研究还不够完善，且该类化合物结构复杂，化学全合成难度大；同时，在STS原料生产和储存过程中均存在产品不稳定的现象，如酸性增强、有效成分降解、含量降低等等。由于在质量标准中须监控其有关物质，因此，提供高纯度的有关物质对照品具有重要意义。随着药品质量标准提高，ICH指导原则要求尽可能提供单杂大于0.1%的有关物质的结构和可能的产生机制、构效关系和药理毒理数据等[7]。本研究通过制备液相技术分离纯化丹参酮ⅡA磺酸钠原料中有关物质的组分，并通过HPLC、MS和NMR分析鉴定出三种有关物质结构，分别确证为丹参酮ⅡB磺酸钠、丹参酮Ⅰ磺酸钠和紫丹参甲素磺酸钠。

1 材料和方法

1.1 仪器与材料

Varian SD-1液相制备及色谱装填系统，色谱柱L&L4001;（2.54 cm×25 cm），色谱柱L&L4002;（5.08 cm×25 cm）；色谱填料ODS-AQ（5 mm，12 nm）和色谱填料PLRP-S（10 mm，10 nm）均购自日本YMC公司；Waters 2695/2489高效液相色谱仪（美国Waters公司）；色谱柱Extend C18 （4.6 mm×150 mm，5 mm，美国Agilent公司）；400M核磁共振波谱仪（NMR Avance Ⅲ400 MHz，瑞士Bruker公司）；超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用仪（Acquitytim UPLC&Q-TOF; MS Premier，美国Waters公司）。

STS原料、纯化水（本公司自制）；甲醇和三乙胺（TEA）（色谱纯，美国Tedia公司）。

1.2 方法

1.2.1 STS样品处理

取STS原料8.0 g进行样品前处理，用纯化水配制成10 mg/ml的STS溶液，在37 ℃条件下减压旋蒸结晶后经滤纸过滤除去析出的固体沉淀，滤液经过0.22 mm有机相微孔滤膜过滤除菌，得到STS原料供试样品。

取STS原料60.0 g，甲醇3.8 L，投入5 L反应瓶中，搅拌加热，澄清后加入16 g药用活性炭，控温65 ℃条件下加热至回流并保持此状态50 min，抽滤后减压旋蒸结晶后滤纸过滤除去析出的固体沉淀，滤液经过0.22 mm有机相微孔滤膜过滤除菌，得到STS精制液供试样品。

1.2.2 有关物质的富集和一步纯化

选用装填PLRP-S聚合物填料的Varian L&L4002;色谱柱。上样体积800 ml，流速为100 ml/min，柱温为25℃，检测波长为271 nm。流动相A为甲醇，流动相B为水，在0～8 min以20%A+80%B洗脱，8～70 min以20%A+80%B继续梯度洗脱至80%A+20%B。根据紫外检测结果实时收集STS有关物质富集样品。

1.2.3 有关物质二步纯化及精制

选用装填ODS-AQ硅胶填料的Varian L&L4001;色谱柱。上样体积800 ml，流速为25 ml/min，柱温为25 ℃，檢测波长为271 nm。流动相A为含0.1% TEA的甲醇溶液，流动相B为含0.1% TEA的水溶液，在0～8 min以20%A+80%B洗脱，8～30 min以20%A+80%B继续梯度洗脱至40%A+60%B，根据紫外检测结果实时收集STS有关物质精制样品。

1.2.4 有关物质HPLC法检测

在有关物质富集、纯化及精制过程中采用HPLC方法对STS样品组成及含量进行全程检测。采用Agilent Extend C18柱（4.6 mm×150 mm，5 mm），上样体积20 ml，流速为1 ml/min，柱温为25 ℃，检测波长为271 nm。

2 结果

2.1 STS原料与STS精制液的有关物质组成

STS原料HPLC检测结果表明，其原料中总杂质含量约为5%左右，主要包含了6种有关物质（编号1～6），其保留时间分别为13.122 min，13.474 min，15.576 min，17.139 min，19.196 min及19.433 min（图1）。

为分析鉴定6种主要有关物质，减少其他杂质的干扰，选用STS精制液来进行有关物质富集。结果表明，STS精制液中含有a和b两种有关物质，其保留时间为13.495 min和19.122 min（图2）、含量为15.59%和32.64%，远高于STS原料中有关物质含量。由于进样浓度不同相同物质出峰时间有微小差异，峰的分离度较好，可判断为同一种物质。

2.2 有关物质的富集与一步纯化

经过HPLC检测，STS精制液通过L&L4002;柱进行一次富集后，可获得HPLC纯度为53.14%的有关物质样品a（保留时间13.508 min）和纯度为40.89%的有关物质样品b（保留时间19.261 min）（图3）。

再经过一步纯化后，有关物质a和b的纯度达到87.60%和82.58%（图4）。

2.3 有关物质的二步纯化及精制

经过二步纯化和精制，获得纯度为98.05%的有关物质a和纯度为98.60%的有关物质b（图5）。将制备得到的有关物质a和b样品中加入STS原料进行HPLC图谱叠加，根据叠加结果推测a可能为STS原料中的有关物质2，b可能为有关物质5（图5）。

2.4 结构鉴定与解析

将上述有关物质2的精制样品溶液进行冻干，得到无定形红棕色粉末。将该样品进行LC-MS分析，测得其分子离子峰C19H17O7S（[M-Na]-）质荷比（m/z）为389.0。进一步对样品进行NMR分析，1H-NMR（D2O，400 MHz）数据显示，两个甲基氢化学位移信号δH 2.289（3H，s，H-17）和δH 1.241（3H，s，H-18）；两个苯氢化学位移信号δH 7.530（1H，J=8.0 Hz，d，H-6）和δH 7.181（1H，J=8.0 Hz，d，H-7）；三个亚甲基氢化学位移信号δH 2.680-2.730（2H，m，H-1），δH 1.401-1.803（2H，m，H-2）和δH 1.401-1.803（2H，m，H-3）；-CH2OH氢化学位移信号δH 3.443-3.678（2H，m，H-19），结合13C-NMR （D2O，100 MHz）δC：29.3（C-1），17.8（C-2），30.8（C-3），39.4（C-4），146.6（C-5），134.7（C-6），121.4（C-7），125.4（C-8），125.0（C-9），149.7（C-10），181.3（C-11），174.5（C-12），119.2（C-13），160.2（C-14），120.5（C-15），147.4（C-16），8.6（C-17），25.5（C-18），69.5（C-19），最终推测其为丹参酮ⅡB磺酸钠（图6）。

将上述有关物质4的精制样品溶液进行冻干，得到无定形棕褐色粉末。将该样品进行LC-MS分析，测得其分子离子峰C18H11O6S（[M-Na]-）质荷比（m/z）为355.026 5。进一步对样品进行NMR分析，1H-NMR（D3COD，400 MHz）数据显示，两个甲基氢化学位移信号δH 2.49（3H，s，H-17），δH 2.71（3H，s，H-19），五个苯氢化学位移信号δH 9.260（1H，J=8.8 Hz，d，H-1），δH 7.532-7.572（1H，m，H-2），δH 7.406（1H，J=6.8 Hz，d，H-3），δH 8.478（1H，J=8.8 Hz，d，H-6），δH 8.004（1H，J=8.8 Hz，d，H-7）。结合13C-NMR（D2O，100 MHz）δC：63.1（C-1），26.4（C-2），30.1（C-3），34.5（C-4），141.1（C-5），136.0（C-6），123.1（C-7），126.3（C-8），126.3（C-9），149.7（C-10），182.3（C-11），175.2（C-12），119.4（C-13），160.6（C-14），121.7（C-15），151.4（C-16），8.7（C-17），30.8（C-18），30.9（C-19），最终推测其为丹参酮Ⅰ磺酸钠（图6）。

将有关物质5的精制样品溶液进行冻干，得到无定形红棕色粉末。将该样品进行LC-MS分析，测得其分子离子峰C19H17O7S（[M-Na]-）质荷比（m/z）为389.0。进一步对样品進行NMR分析，1H-NMR（D2O，400 MHz）数据显示，两个甲基氢化学位移信号δH 1.218（3H，s，H-18）和δH 1.218（3H，s，H-19）分别是18、19位上的甲基信号，符合紫丹参甲素结构，差异在于15位H信号消失，说明15位为磺化反应位置；两个苯氢化学位移信号δH 7.618（1H，J=8.2 Hz，d，H-6）和δH 7.266（1H，J=8.0 Hz，d，H-7）；三个亚甲基氢化学位移信号δH 2.719（2H，J=6.0 Hz，t，H-1），δH 1.530-1.635（2H，m，H-2）和δH 1.530-1.635（2H，m，H-3）说明了其具有萘醌并呋喃环结构骨架；-CH2OH氢化学位移信号δH 4.789（2H，s，H-17），结合13CNMR（D2O，100 MHz），δC：29.5（C-1），18.3（C-2），36.8（C-3），34.3（C-4），145.5（C-5），134.7（C-6），122.7（C-7），125.3（C-8），125.0（C-9），150.7（C-10），181.5（C-11），174.6（C-12），118.3（C-13），161.4（C-14），120.9（C-15），152.2（C-16），30.7（C-17），30.8（C-18），52.7（C-19），最终推测其为紫丹参甲素磺酸钠（图6）。

3 讨论

由于丹参酮ⅡA是从丹参药材饮片中提取，难免混有较低含量的与有效成分相似的结构类似物被引入合成工艺的磺化反应过程中，产生副反应产物；在精制过程重结晶时的共结晶沉淀以及STS原料制备和保存过程中的降解反应等都有可能是有关物质的来源。本研究鉴定了丹参酮ⅡA磺酸钠杂质中的3种主要有关物质，并提供了有关物质的制备方法，该方法制备能力强，效率高，工艺操作连续性强，易于进行质量控制和生产，可作为丹参酮ⅡA磺酸钠对照品的生产工艺进行大规模制备。由于方法及仪器限制，未鉴定出STS原料中其他3种主要有关物质的结构，尚需进一步开展研究。

致谢：感谢洪勇、廖思懿、霍建丽对本文的贡献。

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