鲨鱼皮胶原蛋白制备

肖刚 刘德珠 于颖

摘 要 本文以鲨鱼皮为原料进行胶原蛋白制备，确定了鲨鱼皮为较好胶原蛋白来源，并对胶原蛋白制备工艺进行优化。通过正交试验表明，去除杂质的较佳工艺是0.1 mol/L NaOH、1∶30料液比，处理4 h，其中NaOH浓度和料液比对处理结果有显著影响；去除脂肪的较佳工艺是10%的乙醇、1∶10的料液比，處理16 h，其中，乙醇浓度和料液比对处理结果有极显著影响，而处理时间对脱脂肪有显著的效果。电泳结果表明，这些条件下制备的鲨鱼皮源胶原蛋白质量较高。

关键词 胶原蛋白 鲨鱼皮 提取制备

中图分类号：TQ464.7 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2019）01-0066-04

Preparation of collagen from shark skin

XIAO Gang*， LIU Dezhu ，YU Ying**

（Shanghai Haohai Biotechnology Co.， Ltd.， Shanghai 201613， China）

ABSTRACT Shark skin was used as collagen preparation and determined to be a good source of collagen， and the collagen preparation process was optimized. The orthogonal test showed that the preferred process was to use 0.1 mol/L NaOH at 1：30 ratio of material to liquid and treat for 4 hours for impurities removal， and to use 10% ethanol at 1：10 ratio of material to liquid and treated for 16 hours for fat removal， in which the solvent concentrations and their ratio and time for treatment had a significant effect on the treatment results. The results of electrophoresis showed that the quality of collagen protein prepared from shark skin source is high under these conditions.

KEy WORDS collagen； shark skin； extraction preparation

胶原蛋白（collagen）是一类广泛存在于生物体内的一种纤维状结构蛋白质， 根据分子结构差异分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等多种类型， 其中Ⅰ型胶原蛋白是生物体中最主要的存在形式， 其结构特征是由两条a1和一条a2肽链形成的三螺旋结构。由于胶原蛋白具有良好的凝胶强度、乳化性、低黏度性[1]、生物相容性[2]及吸水和保湿性[3]等，近年来被广泛应用于食品、医药和生物材料、化妆品等领域，其中胶原蛋白为原料所衍生的生物医用材料，已成为医用材料领域最快的增长点之一。随着胶原蛋白及生物材料临床应用研究的不断进展，胶原蛋白医用材料的市场将会进一步扩大。现阶段胶原蛋白生物材料的来源主要是从牛跟腱与牛皮中提取，由于疯牛病、禽流感、口碲疫等问题，国家对动物组织来源的胶原蛋白产品实行严格控制，而海洋生物胶原蛋白由于其功能优良、安全性好且低廉易得，因而在生物材料领域的开发和转化前景广阔。但由于海洋生物胶原蛋白的热变性温度较低等因素，限制它的实际应用，需要通过多种方法和技术进行改性处理，才能应用于医用材料的生产。

近些年已有从草鱼、鲟鱼、罗非鱼等的皮肤及附属物中制备胶原蛋白的报道[4-6]，但从鲨鱼皮中提取胶原蛋白的报道较少。大青鲨（Prionace glauca）属软骨鱼纲真鲨目真鲨科，鲨鱼软骨主要被用作提取硫酸软骨素，鳍条被用作制备鱼翅高附加值产品，而鲨鱼皮是生产过程中的副产物，通常被用作饲料加工。本研究以大青鲨鱼皮为原料，探索制备鲨鱼皮源医用胶原蛋白的制作工艺，并通过正交试验对传统鱼皮胶原蛋白的提取方法进行改良和优化，以期提高鲨鱼皮的附加值，为胶原蛋白原料所衍生的生物医用材料提供更可靠、安全的原料来源。

1 材料与实验方法

1.1 材料与试剂

鲨鱼皮购自浙江省某有限公司；鳕鱼皮购自上海市松江区易初莲花超市。购买后切除鲨鱼头、尾、躯干等部位的皮肤，取背部皮肤，清水反复冲洗后，置于- 20 ℃冰箱内备用。胃蛋白酶（>10 000 U/kg），重庆江峡生化制药有限公司；乙醇（药用级），上海益醇化工有限公司；标准蛋白为Takara公司的Premixed Protein Marker （High）；其余化学试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 胶原蛋白制备方法

参考文献制备胶原蛋白方法[7-8]对提取工艺进行优化。将鲨鱼皮从-20 ℃取出后，用清水漂洗数次。将鱼皮上的残肉剔除后，剪成小块，0.1 mol/L NaOH溶液去除杂蛋白，用去离子水漂洗，10%乙醇溶液进行脱脂质处理，去离子水漂洗；处理结束后，0.5 mol/L乙酸溶液浸泡30 min左右，粉碎，将粉碎的组织移入烧杯，加入0.5 mol/L乙酸溶液漂洗，混合少量的0.5 mol/L乙酸溶液溶解胃蛋白酶，以1∶1 000（重量比）稀释，4 ℃搅拌提取3 d；将提取液于4 ℃ 4 000 g离心20 min，取上清，10 mol/L NaOH调pH至中性， 加固体NaCl至终浓度为2.5 mol/L，进行盐析；盐析12 h后，4 ℃ 4 000 g离心20 min，取沉淀；用0.5 mol/L乙酸溶液复溶，复溶体积比300∶1。 用0.5 mol/L乙酸溶液透析1 d、纯化水透析2 d，至透析液中无NaCl为止（滴加硝酸银试液无沉淀产生），然后真空冷冻干燥，切割成50 mm′50 mm′5 mm的医用胶原蛋白海绵。

1.3 正交试验

1.3.1 杂蛋白去除正交试验

同一批次处理的鱼皮分成9份，每份2.0 g（按湿重计），根据3因素3水平设计正交试验L9（34）进行实验（表1）。取上清液进行蛋白含量测定。

1.3.2 脂质去除正交试验

同上处理并进行脂肪测定（表2）。

1.4 SDS-PAGE分析

参考文献[9]方法，对鲨鱼皮及鳕鱼皮来源的胶原蛋白进行分析。

1.5 数据分析

参考文献[10]对实验数据使用软件DPS 7.05 分析进行方差分析和显著性检验。

2 结果

2.1 正交试验

2.1.1 除杂蛋白

以NaOH浓度（A）、料液比（B）、处理时间（C）、空列（D）4种因素进行正交实验，以洗脱液杂蛋白量为考察指标得到各种条件下鲨鱼皮脱杂蛋白的最佳条件。正交实验结果与方差分析见表3和表4。

由表3和表4结果分析得，对鲨鱼皮除蛋白最重要的因素依次为，NaOH浓度，料液比，处理时间，最佳的工艺处理条件为0.1 mol/L NaOH，1∶30料液比，处理时间为4 h。随着NaOH浓度的提高，鱼皮中的除杂蛋白的效果越好，但是过高的NaOH浓度可能会导致胶原蛋白降解，因此NaOH的浓度不宜选的太高，本实验最终选取的NaOH浓度为0.1 mol/L NaOH。楚水晶等[25]在对马面鱼皮胶原蛋白的制备中得到NaOH 溶液浓度从0～0.1 mol/L，浸出液中蛋白质含量增加趋势明显，蛋白质含量从 1.56%增加到5.28%，鱼皮中大部分非胶原蛋白已经溶出。料液比代表的是底物浓度，酶解过程中随着底物浓度的不断增大，杂蛋白的去除效果越好。随着提取时间的延长，杂蛋白的去除效果越好，但当杂蛋白基本完全溶出后，随着时间的延长效果，效果变得不明显且会对增加生产周期，成本提高，本实验处理时间的最优结果为4 h。

应用最佳工艺件进行稳定性实验，结果表明在最佳条件下三次实验鲨鱼皮脱杂蛋白量处于较高水平，平均值为（719.31±2.32）mg，这与正交实验所得结果相一致，说明正交试验稳定性有效。

2.1.2 除脂质结果

以乙醇浓度（A）、料液比（B）、处理时间（C）、空列（D） 4种因素进行正交实验，以脂质残留量为考察指标得到各种条件下鲨鱼皮脱杂蛋白的最佳条件。正交实验结果与方差分析见表5和表6。

由表5和表6结果分析得，对鲨鱼皮除蛋白最重要的因素依次为，乙醇浓度，料液比，處理时间，最佳的工艺处理条件为10%乙醇1∶30的料液比以及16 h处理时间。

应用最佳工艺件进行稳定性实验，结果表明在最佳条件下三次实验鲨鱼皮脱脂质量处于较高水平，平均值为（1.32±0.11）mg，优于正交实验各条件下所得实验结果，说明所得条件为去除鲨鱼皮脂质的最佳工艺参数。

2.2 验证实验电泳结果

电泳结果表明，鲨鱼胶原蛋白包含一条a肽链（a1和a2，分子质量介于100～120 kD之间）和一条b肽链（a肽链的二聚体）（图1A）。该肽链组成特征与Ⅰ型胶原蛋白的肽链组成高度一致，说明提取所得的胶原蛋白样品均属Ⅰ型胶原。但是对照鳕鱼皮胶原蛋白的电泳结果未见明显条带（图1B），表明该方法对鳕鱼皮胶原蛋白的提取不适用。

2.3 工业化生产及医用胶原蛋白海绵质量

将4.5 kg鲨鱼皮按照上述处理方法进行胶原蛋白的提取，共获得50 mm′50 mm′5 mm胶原蛋白海绵4 683片，按照中华人民共和国医药行业标准YY/T 1511 2017胶原蛋白海绵对获得的鲨鱼皮胶原蛋白进行检测，结果表明我们制备的鲨鱼皮胶原蛋白质量均高于胶原蛋白海绵行业标准，完全满足医用级要求（表7）。

3 讨论

相对于传统的胶原蛋白提取工艺，本研究建立的优化鲨鱼皮胶原蛋白提取工艺简单快捷，便于工业化放大，所制备的鲨鱼皮胶原蛋白质量符合医用级使用要求。由于本研究侧重于生产工艺的优化，但对鲨鱼皮胶原蛋白的热稳定性研究以及后续应用上略有不足，希望在后续研究中能对鲨鱼皮胶原蛋白与目前在医用领域广泛应用的牛/猪等陆生动物来源的胶原蛋白做一个更全面的对比研究，以期扩大鲨鱼皮胶原蛋白在医疗领域中的应用。

参考文献

[1] 蒋挺大. 胶原与胶原蛋白[M]. 北京： 化学工业出版社， 2006： 48-54.

[2] Gopinath D， Ahmed MR， Gomathi K， et al. Dermal wound healing processes with curcumin incorporated collagen films[J]. Biomaterials， 2004， 25（10）： 1911-1917.

[3] 张慧君， 罗仓学， 张新申. 胶原蛋白的应用[J]. 皮革工程与工程， 2009， 30（16）： 106-110.

[4] 汪海波， 梁艳萍， 汪海婴， 等. 草鱼鱼鳞胶原蛋白的提取及其部分生物学性能[J]. 水产学报， 2012， 36（4）： 553-561.

[5] 杨玲， 赵燕， 鲁亮， 等. 鲟鱼鱼皮胶原蛋白的提取及其理化性能分析[J]. 食品科学， 2013， 34（23）： 41-46.

[6] 段宙位， 申铉日， 陈秀明， 等. 罗非鱼尾胶原蛋白的提取与鉴定[J]. 食品科学， 2013， 34（23）： 59-64.

[7] 汪海波， 梁艳萍， 汪海婴， 等. 草鱼鱼鳞胶原蛋白的提取及其部分生物学性能研究[J]. 水产学报， 2012， 36（4）： 553-561.

[8] Zeugolis DI， Paul RG， Attenburrow G. Factor influencing the properties of reconstituted collagen fibers prior to selfassembly： animal species and collagen extraction method[J]. J Biomed Mater Res A， 2008， 86（4）： 892-904.

[9] 萨姆布鲁克J， 拉塞尔 DW. 分子克隆实验指南（第三版）[M]. 黄培堂， 等译. 北京： 科学出版社， 2002： A8.40.

[10] 唐启义. DPS数据处理系统： 实验设计、统计分析及数据挖掘[M].北京： 科学出版社， 2010： 27-29.