布鲁菌病的实验诊断方法及布鲁菌的分子生物学分型方法研究进展

于美美，管程程，张田，李倩

(潍坊医学院，山东潍坊 261053)

布鲁菌是一种兼性胞内寄生革兰阴性小球杆菌，无鞭毛，无芽胞，光滑型菌株有微荚膜，现已被美国疾病预防控制中心列为B类病原体[1]。布鲁菌感染家畜后可随病畜的分泌物、排泄物、流产物及乳汁等排出至环境中，经皮肤、黏膜、眼结膜、消化道、呼吸道等不同途径感染人体。布鲁菌感染可引起布鲁菌病(简称布病)，在全球范围内造成较大经济损失和健康威胁[2]。布鲁菌感染牛、羊、猪等动物，可引起动物流产等；通过直接传播传染人类，引起波浪热、乏力、关节肌肉疼痛、睾丸肿痛等。目前，我国布病的流行地域不断发生变化，给畜牧产业及公共卫生安全带来的经济损失越来越大。对布病进行快速、准确的实验诊断和布鲁菌分型对于布病的防控和治疗具有重要的意义。现将布病的实验诊断方法及布鲁菌的分子生物学分型方法研究进展情况综述如下。

1 布病的实验诊断方法

布病的临床症状复杂多变，生物安全等级较高，实验室安全级别要求较高，一般医院的临床实验室诊断方法有限，诊断准确度欠佳，因此急需提高诊断方法的特异度和灵敏度。目前，布病的实验诊断方法包括细菌培养、免疫学诊断及分子生物学方法等。

1.1 细菌培养 传统的细菌培养技术是布鲁菌鉴定的“金标准”[3]。细菌培养的标本主要取自人和动物的血液、关节腔液、滑囊液、骨髓、脑脊液、流产胎、乳汁、胎盘等，若标本取自菌血症时期，则检出率将大幅提升。但在实际临床应用中，细菌培养不是最常用的方法，胞内寄生、标本差异、病程、操作不当及使用抗生素等均可影响培养结果，且细菌营养要求高，培养耗时长，实验室安全级别要求高[4]。Mangalgi等[5]比较了新的培养方法裂解/浓缩法(LC)、血凝块培养法和传统培养技术，表明LC和血凝块培养法要优于传统培养技术。

1.2 免疫学诊断 免疫学诊断周期短，灵敏度高，对实验室要求不高，更具临床应用价值。布病的免疫学诊断方法有试管凝集试验(SAT)、虎红平板凝集试验(RBPT)、抗人球蛋白试验(CT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、Brucellacapt(免疫捕获凝集技术)、补体结合试验(CFT)、免疫胶体金技术(ICG)、荧光偏振试验(FPA)等。

1.2.1 SAT SAT是我国诊断布病的法定方法，其特异度好，但试验时间长，操作复杂，不适合现场检测和基层采用，慢性患者也可因抗体浓度低而漏诊。Sanodze等[6]对141例布病患者及其家属、近邻进行了分析，25例布鲁菌血培养阳性者中只有23例呈SAT阳性，另2例均为患者家属，说明SAT在早期检测中灵敏度不足。

1.2.2 RBPT RBPT利用虎红染色的抗原检测血清中IgG类抗体，常和SAT联合应用于临床，其灵敏度高，操作简单，成本低，反应时间短，适于布病的大规模初筛。Yohannes等[7]对241例布鲁菌暴露者的血清进行RBPT和SAT的检测比较，显示两者吻合度较好。但RBPT缺乏抗原的标准化，结果依赖主观性判断，温度和凝集时间也会造成特异度和灵敏度下降[8]。

1.2.3 CT CT用于检测布鲁菌感染后血清的不完全抗体，可作为SAT检测的补充，多用于慢性感染时进行诊断，灵敏度和特异度高，但过程较为复杂，其中Coombs试验(CGT)目前最为常用。Borsa等[9]对150例布病患者的血液标本进行检测，发现CGT可用于发现漏检的RBPT阴性的患者标本，且反应速度快，可用作快速筛选试验。

1.2.4 ELISA ELISA主要针对复杂、慢性病例，尤其是其他实验阴性但高度疑似的病例。目前，布病的ELISA检测有间接酶联免疫吸附试验(IELISA)和竞争酶联免疫吸附试验(CELISA)。Madut等[10]对416例发热患者血清采用RBPT、SAT和CELISA进行分析，发现普通门诊的发热患者中CELISA检测的阳性率为23.3%，该方法可用于地区布病的防控。

1.2.5 Brucellacapt Brucellacapt是基于免疫捕获-凝集技术的布病诊断方法，其快速简单，且灵敏度和特异度高，适合急性期和愈后随访，得到了国际认可。Peeridogaheh等[11]对11例布鲁菌血培养阳性患者的血清进行检测，发现Brucellacapt全部呈阳性，灵敏度优于ELISA，说明Brucellacapt是在布病流行区进行诊断的有力工具。

1.2.6 CFT CFT通过标本内抗原抗体复合物同补体结合，暴露抗原或抗体进行诊断，灵敏度和特异度较高，但操作复杂，一般不用于常规检验，仅作为确诊试验或用于判断其他方法难以确诊的样品。Ayala等[12]对116例有布病症状但血培养阴性患者的血清进行检测，发现CFT阳性检出率高于IELISA。

1.2.7 ICG ICG是以胶体金为标志物标记抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，其简单、快速、准确、无污染，灵敏度高、稳定性强，且用量少，易于进行现场检测。目前，用于布鲁菌检测的主要有胶体金免疫层析技术(GICA)。孙华丽等[13]对137例布鲁菌感染确诊病例和78例非布鲁菌感染患者的血清进行检测，GICA的灵敏度和特异度可达90.51%和93.59%。

1.2.8 FPA FPA通过测定游离抗原与抗原—抗体复合物分子转动率的不同来检测相应抗体，灵敏度和特异度极高，操作简单省时，适用于不同样品的检测，能用便携设备进行反应。Lucero等[14]对587例患者血清使用FPA进行了检测，特异度和灵敏度较高，且测试相对便宜。

1.3 分子生物学方法 分子生物学方法安全有效，简单快速，灵敏度高，特异度好，样品需求量少。目前，用于布鲁菌检测的分子生物学方法有聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)等。

1.3.1 PCR PCR技术于1996年首次被应用于布病的诊断中[15]，微量高效，特异度和灵敏度高，对样本的种类和纯度没有特殊要求，能鉴别疫苗株和野毒株。Mohseni等[16]对100份疑似患者的血清标本使用ELISA、PCR和SAT进行了检测，其中50份SAT检测呈阳性，45份PCR呈阳性，提出同时使用血清学和分子技术可克服检测的限制。

1.3.2 LAMP LAMP是一项恒温核酸扩增技术，特异度强，灵敏度高于普通PCR，操作简单迅速高效，无需特殊设备，结果能用肉眼观察，更适合布病流调现场或基层卫生防疫[17]。Trangoni等[18]对布鲁菌进行LAMP检测，表明其灵敏度与PCR一致，并可对所有生物型进行鉴定，有助于缩短在配置较低的实验室中进行检测的时间。

1.3.3 MALDI-TOF-MS ALDI-TOF-MS是通过质谱指纹图进行细菌鉴定的技术，灵敏度高，操作快速准确，是目前公认的诊断方法，但操作复杂，用时长，必须依赖已知菌株的谱库。Ferreira等[19]对131例临床分离布鲁菌进行鉴定，属间鉴定准确度达100%，并可直接使用血培养瓶中的样品。

2 布鲁菌的分子生物学分型方法

细菌分型对于布病的流行病学监控，以及研究布鲁菌的致病机制和耐药性监测具有重要意义。传统分型方法操作繁琐，无法鉴定部分非典型菌株，难以满足布病防控的需要。分子生物学分型灵敏度、特异度、重复性更佳，更适合快速分型和溯源分析。常用的布鲁菌分子生物学分型方法包括PCR、脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)、多位点序列分型(MLST)、多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)、高变量八聚物寡核苷酸指纹分析(HOOF-Prints)等。

2.1 PCR 目前，有多种PCR方法用于布鲁菌的分型，布鲁菌多重PCR(AMOS-PCR)就是一种，其快速简便，应用价值较强，与传统分型方法一致性达100%，与其他无关细菌无交叉反应。1994年Bricker等[20]首次将AMOS-PCR应用于布鲁菌分型。王月等[21]对12株布鲁菌进行分型，PCR方法与传统方法结果一致，并可确定当地感染的主要动物传染源。

2.2 PFGE PFGE是进行脉冲场电泳从而得到DNA图谱的分型技术，鉴别能力强，稳定性好，分辨率高。赵嘉咏等[22]通过PFGE技术将20株布鲁菌进行分型，得出其分别属于不同的族群和带型，为布鲁菌病原学研究积累了分子基线数据。但该技术费时费力，且对操作人员有一定技术要求。

2.3 MLST MLST通过对多个管家基因进行测序，利用核苷酸序列变异鉴定细菌型别，将布鲁菌分为不同的序列型(STs)，重复性好，分辨率高，但费用较高。Shome等[23]对27株布鲁菌进行了MLST分型，显示这些菌株属于5种不同的STs；MLST可有效对野毒株和标准菌株之间的关系进行分析，并为临床分型和预防接种提供依据。

2.4 MLVA MLVA是根据细菌同源重复序列数目差异设计的分型方法，能鉴定传统方法无法分型的布鲁菌，分辨率高，重复性好，可用于传染源的查找和国际间菌株的比较。目前，应用于布鲁菌分型方法的主要有MLVA-8、MLVA-11和MLVA-16[24]。Sun等[25]对59株布鲁菌进行MLVA和MSLT分析，发现这两种方法有助于了解疾病的传播和传染源的检测。

2.5 HOOF-Prints HOOF-Prints主要针对布鲁菌基因组中八聚物片段AGGGCAGT的重复数目不同而进行分型[26]，分辨率高，重复性好，能将传统分型方法不能分型的非典型菌株进行分型。刘志国等[27]对83株布鲁菌采用HOOF-Prints方法进行基因分型，重复性较好，证实在布鲁菌疫情爆发时HOOF-Prints是进行流行病学分析的有效补充手段。

综上所述，近年我国布鲁菌的感染率逐年上升，在积极防治的同时，准确诊断和分型也成为研究者积极探索的方向。但目前并没有一种技术能同时满足低成本、高分辨率、高灵敏度、高特异度、分型能力强、重复性好、易推广等诸多特点，相信不久能研究出更理想的方法，为布病的诊治、流行趋势的掌控，人畜间布病防控提供强有力的支撑。