间充质干细胞治疗急性移植物抗宿主病机制及应用进展

刘茂兰 史明霞

1 昆明医科大学第一附属医院血液科（昆明650032）；2云南省血液病研究中心（昆明650032）

异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）是恶性或难治性血液疾病唯一可能治愈的方法，主要通过移植物抗肿瘤效应（graft-versus-leukemia，GVL）发挥作用。然而，allo-HSCT 后常伴有急性移植物抗宿主病（acute graft-versus-host disease，aGVHD）的发生。移植后aGVHD 的发生是患者非复发死亡的主要原因，严重影响患者的生存质量甚至威胁生命。aGVHD是遗传上不相同的供体移植的免疫细胞识别HSCT 受体中的同种抗原并且被同种异体抗原激活时导致器官损伤的病理过程［1］。因此，抑制aGVHD 的发生是移植成功的关键。目前，标准的皮质类固醇激素治疗的总体有效率为50%，各种免疫抑制剂治疗的完全缓解率约为30%。尽管糖皮质激素及免疫抑制剂能部分控制aGVHD 的进展，但治疗期间仍可产生严重的激素耐药、继发感染以及伴随着移植物抗肿瘤效应（GVL）的减弱等，最终导致患者治疗不耐受或者肿瘤的复发。因此改良治疗方案，寻求新的治疗策略迫在眉睫，而间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）作为新的治疗aGVHD方法，临床上已获得显著的疗效。

MSC 具有支持造血、促进造血重建、低免疫原性及免疫负调节作用。其独特的免疫负调控作用具体表现在可通过直接接触和（或）分泌可溶性细胞因子途径与几乎所有免疫细胞，包括树突状细胞（dendritic cells，DC）、T 淋巴细胞、自然杀伤细胞（natural killer，NK）、B 淋巴细胞、巨噬细胞等相互作用，有效控制过激的免疫反应，但具体机制目前并不十分清楚。本文就近年来MSC 治疗aGVHD 的相关作用机制研究进展及临床应用作一综述。

1 MSC 的抗aGVHD 的作用

目前认为aGVHD 发生的病理过程大致为：移植前预处理或炎症引起组织损伤，使宿主细胞分泌炎性因子刺激抗原提呈细胞（antigen presenting cells，APC）的成熟；APC激活供者T 淋巴细胞，促使其增殖和分泌多种细胞因子形成细胞因子风暴；炎症因子募集并诱导效应细胞增殖，从而攻击宿主皮肤、肝脏、肠道等靶器官产生aGVHD［2］。MSC 不管单独静脉注射或与移植物共同植入宿主体内，将因归巢特性迁移至受损的靶器官起到修复组织的作用，减少炎性因子的释放，同时因免疫负调控作用抑制机体过激的免疫反应，共同治疗aGVHD。MSC 抗aGVHD 作用的具体机制目前尚未明确。近年的研究证实，移植后输注MSC 可通过阻断DC 分化成熟，抑制T 细胞增殖活化并促使T 细胞亚群向抑炎方向分化；诱导NK 细胞迁移而定向发挥其GVL 作用；促进调节性B 细胞（regulatory B cells，Breg）产生同时抑制抗体生成；诱导M2 型吞噬细胞的转化，减弱其抗原呈递，增加吞噬能力及促进组织修复，从而减轻或延缓aGVHD 的发生发展。

2 MSC 对DC 的免疫调节作用

DC 是专职抗原提呈细胞，可向T 细胞提供活化的协同刺激信号，诱导初始T 细胞的活化，同时DC 可介导免疫耐受，维持机体的稳态。已知MSC 发挥其强大的免疫调节效应需要炎症环境，如干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、白细胞介素1α（interleukin-1α，IL-1α）、IL-1β 或肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等的刺激。此外，有报道提出MSC 来源的外泌体的活化需DC 介导。ZHANG 等［3］证明只有APC 刺激的CD4+T 细胞能成功诱导Treg。并且，这种诱导是外泌体及APC 剂量依赖性的。

DC 的成熟、识别并向T 细胞呈递抗原的功能是aGVHD 疾病发展的第一步。有研究表明，MSC 分泌的细胞因子如前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、IL-6、巨噬细胞集落刺激因子（macrophage-colony stimulating factor，MCSF）和Jagged-2 等起着抑制DC 分化的作用。DENG 等［4］发现DC 成熟分化受到抑制并朝免疫耐受转化，同时共培养后的DC 对LPS 刺激的反应降低。共培养体系中高表达IL-6，脐带MSC 细胞表面高表达细胞因子信号抑制物1（suppressor of cytokine signaling l，SOCS l），通过免疫抑制剂及siRNA 证实MSC 分泌的IL-6 可上调SOCS l 的表达，并通过Janus 激酶/信号转导子和转录激活子（janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT）途径激活SOCS1，从而阻断DC 中Toll 样受体（toll-like receptors ，TLR）4 信号通路，抑制DC 成熟分化。LIU 等［5］证实MSC 分泌抗炎蛋白肿瘤坏死因子刺激基因（tumor necrosis factor stimulating gene，TSG）-6 能抑制LPS 促进DC 的成熟。TSG-6 是通过抑制由LPS 诱导的DC 中丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子κB（nuclear factor Κb，NF-κB）的信号传导，从而抑制DC 的成熟和功能。

MSC 通过抑制DC 分化，同时减少主要组织相容复合物II 类分子（major histocompatibility complex II，MHC II）、CD40、CD80、CD86 的表达，抑制T 细胞的活化。MSC 还促使成熟DC 向不成熟逆转，表现为降低IL-12、TNF-α 和IFN-γ 促炎因子的分泌，增加抑炎性细胞因子IL-10 的分泌。其中IL-12 的缺失诱导了T 细胞的无能和耐受，同时影响NK 细胞分泌INF-γ。脾脏基质细胞诱导的调节性DC（regulatory DC，DCreg），通过诱导T 细胞表面高表达凋亡相关因子配体（Fas ligand，FasL）促进其分泌IFN-γ，同时促使DCreg 产生一氧化氮（nitric oxide，NO）而诱导T 淋巴细胞凋亡［6］。此外，还可通过降低DC 中信号传导及转录激活因子1（signal transducers and activators of transcription 1，STAT1）的磷酸化而降低DC 中的CC 趋化因子受体7（CC chemokine receptor 7，CCR-7）和基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinases-9，MMPs-9）水平，降低向外周淋巴结区域的迁移能力，减弱免疫排斥反应。MMPs-9 裂解T 细胞表面分子CD25，使得T 细胞对IL-2 的刺激无反应，从而抑制T 细胞的激活［7］。

3 MSC 对T 细胞的免疫调节作用

aGVHD 为自身免疫性疾病，主要的病理过程由活化的供者T 细胞大量活化、增殖产生炎症风暴促成。在混合淋巴细胞反应、丝裂原刺激以及抗CD3 或CD28 抗体刺激的淋巴细胞反应体系中，MSC 均可抑制T 淋巴细胞的增殖，使T 细胞的细胞周期停滞于G0/G1 期。MSC 对T 细胞可通过直接接触或分泌可溶性细胞因子的途径发挥其作用，直接接触途径包括程序性死亡受体-1/程序性死亡配体-1（programmed cell death-1/programmed cell death ligand-1，PD-1/PD-L1）、Jagged-1、Fas/FasL、粘附分子等。其中，Fas/FasL 系统对于炎性疾病的MSC 治疗是至关重要的。Fas 增强T 细胞的迁移，而FasL 激活T 细胞的凋亡途径。Let-7a 是MSC 中Fas 和FasL 的 负 调 控 分 子，通 过 与 其mRNA 上3′UTR 端结合发挥作用。YU 等［8］利用RNA 干扰特异性敲低MSC 中Let-7a，从而增加细胞中Fas 和FasL 的表达水平，增强MSC 诱导的T 细胞迁移和凋亡，抑制炎症反应，减轻实验性结肠炎和GVHD 小鼠模型的组织损伤。

可溶性细胞因子的作用是被人们广为研究的MSC 免疫调节途径，不仅种类繁多，而且在人体中发挥重要作用。由MSC 分泌的可溶性因子主要有TGF-β、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、PGE-2、IL-4、IL-6、IL-10、吲哚胺2，3-二氧化酶（Indoleamine2，3-dioxygenase，IDO）、NO、人白细胞抗原-G5（human leucocyte antigen-G5，HLA-G5），以及新发现的胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）、PD-L1 等。MIYAGAWA 等［9］发现培养的人MSC 的上清液对Treg 的诱导作用可通过添加IGF 增强，添加IGF 抑制剂而减弱。同时，在人MSC 培养上清中可检测到IGF 的一种抑制剂-IGF 结合蛋白-4（IGFBP-4），由此得知机体可自发的调节以维持内环境的稳定。PD-1是T 细胞活化和稳态控制的重要调控因子。MSC 除了已知的细胞表面表达PD-1 的配体外，DAVIES 等［10］发现在MSC 暴露于IFN-γ和TNF-α介导的促炎环境时，还可分泌PD-L1、PD-L2。通过相应的阻断试验证实分泌的PD-L1 具有抑制CD4+细胞的活化，下调IL-2 分泌，并诱导T 细胞不可逆的低反应性和细胞死亡的功能。PD-1 介导的对T 细胞的抑制作用表现在T308 处蛋白激酶B（protein kinases B，AKT）磷酸化减少和AKT 随后的转录因子Foxo3 的表达增加，这种作用可以通过阻断PD-L1 而逆转。

Treg 为CD4+CD25+Foxp3+的一类抑制性的T 细胞亚群，在抑制自身免疫及诱导免疫耐受方面发挥重要作用。在炎性环境下，MSC 可调节T 细胞亚群朝着抑炎方向分化，即调整辅助T 细胞（T helper cell，Th）Th1/Th2 向Th2 分化，促使Th17 通过细胞间接触抑制激活其凋亡受体，并分泌PGE2、IDO 等可溶性细胞因子诱导Treg 产生。此外，分泌IL-10 的DCreg 可通过Notch 信号通路促进CD4+CD25-T 细胞向CD4+CD25+Treg 转化以扩增Treg，共同促使机体产生免疫耐受。大量的文献报道，稳定的Foxp3 表达在Treg 的表型和功能稳定性中起主要作用，但在特定的炎症条件下，炎症性Treg 可能会失去Foxp3 的表达并转化为效应T 细胞。MSC 可通过细胞间接触的方式增加Treg 特异性去甲基化区域的Runt 相关转录因子1（runt-related transcription factor 1，RUNX1）、RUNX3 和CBFβ复合物的表达，以增强Foxp3 的稳定性；Runx-Foxp3 复合物的基因转录后调控，可诱导传统T 细胞向Treg 转化以此放大Treg 的免疫抑制功能［11］。IL-35 是IL-12 家族的最新成员，可通过诱导T 细胞无能和凋亡，以及诱导生成Treg 参与维持机体免疫耐受。IL-35 是一种可促进iTr35 细胞（诱导型Treg 的一种，具有抑制T 细胞的功能，但不表达Foxp3 和IL-10）生成的抑制性细胞因子。GUO 等［12］发现过表达IL-35，可增加Treg 细胞的增殖和抑制效应T 细胞的功能，减少同种异体移植物排斥反应的发生。WANG 等［13］通过在MSC 中过表达IL-35，发现MSC 可特异性迁移至损伤的肝脏组织，通过减少单核细胞的FasL 表达来阻止肝细胞凋亡，最重要的是通过JAK1-STAT1/STAT4 信号通路调控，降低肝脏单核细胞INF-γ的分泌，更好的发挥免疫抑制功能，有效的治疗刀豆蛋白A 诱导的暴发性肝炎。

4 MSC 对NK 细胞的免疫调节作用

NK 细胞的生物学特性受到一组细胞表面受体（激活或抑制）和不同的促炎细胞因子（IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21）紧密调控。炎性细胞因子一旦激活NK 细胞，NK 细胞通过释放穿孔素和颗粒酶以及分泌IFN-γ和TNFα介导抗体依赖的细胞毒作用及“自发的”杀伤作用［14］。同时，NK 表面的抑制性受体和相应的配体结合，可抑制NK 细胞的活化，维持机体的免疫耐受。在MSC 与NK 细胞体外共培养体系中，添加IL-2、IL-15 细胞因子可诱导的NK 细胞的增殖和裂解活性降低，同时分泌的IFN-γ和TNF-α明显下调。而对于激活的NK 细胞，MSC 不能或只能部分抑制其增殖。由此可知，异基因移植效果与移植前NK 细胞是否激活的状态相关［15］。

在HSCT 后早期重建阶段，NK 细胞的抗肿瘤特性在GVL 应答中特别重要，尤其对于预防GVHD 进展和白血病复发。有研究者发现BM-MSC 触发NK 细胞脱颗粒并增加其穿孔素和颗粒酶的释放，激活的NK 细胞在BM-MSC 内诱导活性氧（reactive oxy gen species ，ROS）产生，导致丝氨酸B9 活性降低和表达减少，从而裂解自身或异体的MSC。由于IL-2 诱 导 的NK 细胞 表 达NKp30，NKG2D 和DNAM-1 天然细胞毒性受体，介导细胞毒活性。由此推测MSC 细胞表达ULBPs、PVR 和Nectin-2 已知天然细胞毒性配体［15］。

5 MSC 对B 细胞的免疫调节作用

MSC 可以使B 细胞增殖阻滞于细胞周期G0/G1 期，抑制B 细胞的成熟，从而减少IgM、IgG 和IgA 的产生。脂肪来源的MSC 还可抑制B 细胞分泌IgE，抑制机体过敏反应。 ROSADO 等［16］提出MSC 与T 细胞的直接接触是MSC抑制B 细胞增殖、分化以及抗体产生的关键。MSC 还可抑制CCR7、CXCR4、CXCR5 及其配体CXCL13、CXCL12 的表达，从而改变B 细胞的趋化能力。

B 细胞在针对抗原的适应性免疫应答中具有核心作用，效应B 细胞是通过激活自身反应性T 细胞，产生促炎性细胞因子而促进自身免疫疾病的发展。Breg 是一群特殊的B 细胞亚群，以剂量依赖的方式通过产生IL-10，抑制CD3/CD28 刺激的自体CD4+T 细胞的增殖及干扰素-γ 产生，以维持免疫耐受性和抑制过激炎症反应。由此看来，调节效应B 细胞和Breg 两者之间的平衡是治疗自身免疫性疾病的关键。

CHO 等［17］发现T-MSC 对B 细胞亚群的诱导是通过分泌IL-35 介导的，其中IL-35 中的EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）亚基起着至关重要的作用。已知，基质细胞衍生因子-1（stromal cell derived-factor-1，SDF-1）-CXCR7 轴能维持MSC 活性并发挥旁分泌功能。低剂量的SDF-1α 可促进免疫抑制功能，促进Breg 的生成及IL-10 的分泌。高剂量的SDF-1α 则发挥抑制作用［18］。

6 MSC 对巨噬细胞的免疫调节作用

巨噬细胞因局部微环境的不同表现出不同的功能表型，即促炎性巨噬细胞M1 和抗炎巨噬细胞M2。与MSC 共培养后，巨噬细胞除了表达激活的巨噬细胞标志CD206 和CD163 外，还增加了抑制性分子PD-L1 和PD-L2 的表达，同时增加了抑炎因子IL-6、TGF-β、精氨酸酶-1、CD73 的表达，降低促炎因子IL-12 和TNF-α的表达［19］。MSC 对巨噬细胞调节的具体的机制尚不清楚。BOUCHLAKA 等［19］发现与MSC 共培养的巨噬细胞（MEM）具有独特的基因表达谱，其中IL-6 基因高表达。通过ELISA 证实MEM 比M2 的IL-6 蛋白高4 倍，并能被环氧化酶抑制剂，精氨酸酶抑制剂，JAK1/STAT1 抑制剂所缓解。由此可知，IL-6 的分泌部分受环氧化酶（cyclooxygenase2，COX2），精氨酸酶和JAK1/STAT1 三条不重叠的通路共同调控。此外，通过尾静脉注射MEM 治疗皮肤GVHD 小鼠及放射损伤的小鼠时，能显著提高其生存率［19］。

7 MSC 治疗aGVHD 的临床应用

MSC在GVHD治疗中最初的临床应用是由LE BLANCE等［20］发起并证实MSC 治疗aGVHD 的临床安全性和可行性。这项研究推动了使用自体、单倍体相合或第三方HLA不相合的MSC 治疗类固醇耐药的难治性aGVHD 的临床试验的开展。由JCR 制药公司将健康无关志愿者骨髓MSC 制备成药物制剂（JR-O31），经过多中心Ⅰ/Ⅱ期及随后进行的Ⅱ/Ⅲ期临床研究表明，MSC 作为激素耐药的aGVHD 患者的挽救性治疗，可以成功改善患者临床症状，延长生存期，且注射MSC 期间未出现迟发或严重的副作用［21］。用于治疗全身性疾病的干细胞药物Prochymal的Ⅲ期随机双盲研究表明，在临床结果方面对照组（未行MSC 治疗）和异基因MSC 组并无显着差异。近期一项评估MSC 对类固醇耐药的难治性aGvHD 的挽救性治疗的研究报道激素耐药的重度aGVHD 患者临床症状得到改善，仅2 例患者（4.3%）出现急性短暂副作用（恶心/呕吐和视力模糊）［22］。MSC 再次被推荐为类固醇耐药难治性aGVHD 的挽救治疗方案。

SALMENNIEMI 等［23］的前瞻性单臂研究中，发现长期的低存活率意味着MSC 治疗不会在严重的aGVHD 中诱导免疫耐受，而是暂时打破GVH 反应的恶性循环。此外，大量类似的临床研究得到类似的评估结果［24-25］。MSC 可以安全的应用于类固醇难治性的GVHD 的治疗，辅以延长免疫抑制治疗和高效的预防感染可以显著改善MSC 的疗效。

因患者的临床反应与在aGVHD或组织损伤部位相关的生物标志物水平下降相关，有报道提出联合监测aGVHD生物标志物，如人再生胰岛衍生蛋白3α（肠道GVHD）、细胞角蛋白18（cytokeratin18，CK18）（肝-肠GVHD）、Elafin（皮肤GVHD）等，可用于预测MSC 干预后的疗效［26］。近期有研究提出CK18F，即由细胞角蛋白18 凋亡降解产生的细胞碎片，可提高急性肝-肠GVHD的预测效果［27］。此外，肿瘤抑制素2（suppression of tumorigenicity 2，ST2）不仅可用于预测aGVHD 发生，还可评估患者发生难治性GVHD 及移植后无复发死亡的风险，从而指导下一步治疗［28］。

8 结语

MSC 因其独特的生物学及免疫特性，已成为自身免疫疾病细胞治疗的重要种子细胞。目前MSC 用于治疗aGVHD 临床试验方面的应用取得了良好的效果，但涉及具体机制尚未清楚。目前所知的结论仅限于细胞及动物试验，临床研究只是冰山一角，太多的未知及尚未解决的问题，如怎样避免移植后减轻aGVHD 的同时削弱GVL 效应、如何更准确的预判MSC 疗效、MSC 的输注时机等，需要更多的大型多中心随机、对照、分层的研究才能具有针对性的解决问题，并取得突破性的进展。