肿瘤血小板在非小细胞肺癌诊疗中的研究进展

王禾 翟坚学 刘曦光 冯思阳 董晓颖 史晓舜 卢笛 吴华李梅 蔡开灿

南方医科大学南方医院胸外科（广州510515）

在世界范围内，肺癌是威胁人类健康主要的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率均居首位［1］，其起病隐匿，早期缺乏特异性的临床表现，当患者出现症状就诊时往往处于局部晚期或已发生远处转移，预后往往较差。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的病例约占所有诊断为肺癌病例的85%，NSCLC 主要包括腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌等类型。目前组织活检是肺癌诊断的金标准，但组织活检具有局限性和风险性，特殊部位的肿瘤可能无法进行活检，可能需要反复活检并且不能完全避免手术并发症，不能作为常规筛查方法，不能反映肿瘤的克隆异质性［2］。

近年来，液体活检已成为肿瘤诊断的重要工具，可以通过体液（如唾液、尿液和血液）检测特异性肿瘤生物标志物。与常规肿瘤组织活检相比，分离体液更为简便、快速、安全，并且便于重复采样和作为无法取得组织活检时的诊断替代品。目前在NSCLC 中的应用的液体活检来源有循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）、循环游离DNA（circulating cell-free tumour DNA，ctDNA/cfDNA）、肿瘤血小板（tumor-educated platelets，TEPs）和胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）［3］。2015年BEST等［1］首次提出TEPs的概念［4］，TEPs 是肿瘤患者体内与肿瘤相互作用的病理生理过程中受到肿瘤细胞和肿瘤微环境“教育”的血小板，被认为由癌症存在时的局部和系统性应答转化而来［5］。TEPs 易于分离及检测，是一种新型的液体活检来源，多项研究研究表明TEPs 具有在NSCLC 的诊断、疾病监测及预后评价上的潜力和优势［4，6-7］。以下将对TEPs 及其在NSCLC 中的研究进展进行综述。

1 TEPs 概述

1.1 血小板的生物学特征 正常人每毫升血液中含有约2 ～5 亿个血小板，血小板在体内的平均寿命约为10 d［8］。血小板是来自骨髓巨核细胞的无核循环细胞片段，通过在损伤部位形成肌动蛋白丝粘附和聚集发挥止血作用［9］。血小板在其生命周期中可以吸收并携带蛋白质和核酸［10］，其中包括mRNA、前体信使RNA（pre-messenger RNA，premRNA）、小RNA（microRNA，miRNA）、长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）、环状RNA（circular RNA，circRNA）和线粒体DNA［11］。

血小板可以分泌影响细胞生长和血管生成的生长因子，还能吸引其他血细胞（如单核细胞和粒细胞），创造一个有助于肿瘤转移的微环境［12］。并且，血小板也可以在肿瘤组织中浸润［13］，可能持续地在肿瘤微环境中定植和排出。肿瘤细胞生长、侵袭、扩散、迁移、渗出和远处转移扩散的步骤都有血小板的参与［9，14］，且肿瘤进展使血小板呈现出高反应性［15］，可能是肿瘤患者血小板活化和血栓形成风险增高的一个因素［16］。血小板与肿瘤的互相作用一直受到关注，并且被认为是一种潜在的肿瘤诊断工具。

1.2 TEPs 形成的生物机制 血小板中含有RNA，通过测序的手段定性、定量分析其中RNA 的组成，从而记录血小板在特定状态下的RNA 成员和丰度信息，由此形成的数据表为血小板的RNA 谱。在血小板的生命周期中，其RNA 含量逐渐减少［17］，表明巨核细胞提供的RNA 是血小板在血液循环以及浸润到肿瘤原发部位或转移瘤时的活动所必需的［18］，但肿瘤的病理生理状态对于骨髓巨核细胞的影响尚不明确。在肿瘤患者体内，TEPs 的RNA 谱受到病理生理条件的动态影响［4］，因此可能作为肿瘤性疾病领域诊断、监测或预后评估的生物标志物［19］。

导致TEPs 的RNA 谱改变的生物学机制和由此产生的生物学效应尚不明确，目前对这一现象的解释基于肿瘤及其微环境引起的血小板内pre-mRNA 剪接的假设基础［18］。血小板中不含细胞核，所含RNA 的水平变化可能通过转录后pre-mRNA 的选择性剪接来实现［20］。当血小板遇到肿瘤细胞释放的含有肿瘤相关的生物分子（如肿瘤特异mRNA）的外泌体后，血小板摄取这些外泌体并保护这些分子不被降解［19］。肿瘤细胞和肿瘤微环境（如基质细胞和免疫细胞）释放的生物分子可能使血小板中发生剪接事件并转化为TEPs［4］。剪接事件可以部分通过选择性剪接事件来解释，并且剪接事件可能部分依赖于RNA 结合蛋白的活性［7，18］。此外，在TEPs 中对pre-mRNA 的调节还可以由miRNA［21］和circRNA［22］来实现。

1.3 TEPs 的检测 在肿瘤诊断中应用TEPs 要保证体外分离的血小板的状态与体内的血小板相似，以避免生物化学或物理扰动引起血小板活化，导致其形状改变及内容物释放［4］。目前的检测方法中，首先使用EDTA 抗凝管采集全血约6 mL 储存过夜，24 h 后处理，通过临床检验记录获取血小板计数信息［7］，为了保持TEPs 中RNA 的质量和特征，全血在室温下的储存时间应＜48 h［10］。为分离纯化血小板，先应用120 ×g 离心20 min 将富含血小板的血浆与有核血细胞分离，之后通过360×g离心20 min 分离富含血小板血浆纯化得到浓缩的完整血小板［7］。通过结晶紫染色后在光镜下验证血小板的纯度，每1 千万个血小板显示的有核细胞应＜5 个［20］，表明TEPs 的RNA 谱不受有核细胞的污染，满足进一步检测的标准［10］。然后提取血小板RNA并扩增进行测序，最后在RNA 水平上进行TEPs 综合分析。

2 TEPs 与NSCLC

2.1 TEPs 在NSCLC 诊断中的作用 2015年，BEST 等［4］提出了基于TEPs 的新型液体活检来源及分析方法，通过对283 份血小板样本的mRNA 测序，应用留一交叉验证的支持向量机算法（leaout -one-out cross-validation support vector machine algorithm，LOOCV SVM），以96%的准确率区分228例局限性和转移性肿瘤患者和55 例健康受试者，以71%的准确率区分6 种原发肿瘤（NSCLC、结直肠癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌、肝及胆管癌、乳腺癌）的起源器官，给定分类算法的两个疑似器官时，准确率最高可达到89%。仅在探讨NSCLC 时，该算法在训练组和验证组中区分NSCLC 患者和健康受试者的准确率分别为75%和79%［4］。由于研究纳入的NSCLC 患者大部分处于晚期，该算法是否适用于早期NSCLC 的检测仍需进一步验证。此外，该研究在TEPs 用于区分不同类型的肿瘤时主要受肿瘤类型的影响，较少受肿瘤进展和转移的影响（未转移瘤与转移瘤比较差异无统计学意义），可能与每种肿瘤类型的患者数量较低，不允许对局限性和转移性肿瘤进行有统计学意义的分层有关［23］。

2017年，BEST 等［7］应用TEPs 对NSCLC 进行了后续研究，该研究纳入了不同分期的NSCLC 患者，其中包含了对年龄、吸烟习惯、炎症状态的分析，并且对血小板分离时间进行标准化。为了选择一个稳健的生物标记物集，迭代优化生物标记物的粒子群优化（particle-swarm optimization，PSO）算法［24］被用于识别最佳的生物标志物，PSO 算法用于区分245 例Ⅳ期NSCLC 患者和273 例健康受试者的准确率为89%，用于区分53 例Ⅰ至Ⅲ期NSCLC 患者和53 例健康受试者的准确率为81%，PSO 算法对NSCLC 诊断的准确性随着样本的增加而提高，并且不受患者的年龄、吸烟习惯、全血贮存时间和炎症状态影响［7］。BEST 等［7］开发了基于RNA-seq 检测TEPs 中生物标记物的检测平台thromboSeq，能够从100 ～500 pg 血小板RNA（相当于一滴血中的血小板）中识别出TEPs 的RNA 谱，PSO 算法驱动的thromboSeq平台允许为TEPs 的癌症诊断提供稳健的生物标记物选择，也可能扩展到其他疾病和液体活检来源的应用。

2.2 TEPs 在NSCLC 疗效预测中的作用 表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变和肝细胞生长因子受体（hepatocyte growth factor receptor，MET）扩增作为肺腺癌的驱动基因可预测靶向治疗的疗效，KRAS 突变可在肿瘤的临床管理和决策过程纳入考虑［25］。BEST等［4］确定了TEPs 中与肿瘤组织分子亚型相关的剪接RNA 标记，应用LOOCV SVM 区 分NSCLC 患者 中EGFR 突 变、MET 扩增和KRAS 突变的准确率分别为87%、91%和90%，但用于区分的患者例数较少（分别为60、23 和60 例），各算法中的标记物数量分别200，24 和421，因此这些算法存在较高的过拟合风险。

NILSSON 等［6］采用反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）对77 例NSCLC 患者的血小板和血浆进行棘皮动物微管相关蛋白样4（echinoderm microtubule-associated protein-like 4，EML4）-间变淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）融合基因分析，发现通过TEPs 分离肿瘤来源的RNA 分子检测EML4-ALK融合基因的准确率为86%；对29例EML4-ALK 融合基因的NSCLC 患者应用克唑替尼进行治疗，发现循环TEPs 中EML4-ALK 转录本的数量可降低，同时通过TEPs 检测EML4-ALK 融合基因的结果与无进展生存期和总生存期相关。他们通过TEPs 检测对一个EML4-ALK 融合基因阳性的患者进行了近3年的监测，并在影像学发现疾病进展前两个月检测到肿瘤对克唑替尼的耐药性［6］。由于正常血小板的生命周期短，肿瘤来源的转录本可以在TEPs 中积累，并隔离了循环系统中的核糖核酸酶，因此应用TEPs 的RNA 分析可能反应了最新、动态的肿瘤活动信息［18］。

DIEM 等［26］报道了血小板与淋巴细胞比率升高与NSCLC 患者应用纳武单抗（nivolumab）抗细胞程序性死亡-配体1（programmed death receptor-1，PDL1）免疫治疗的应答率降低的相关性，提示了在抗肿瘤免疫反应中循环血小板的促肿瘤效应［32］。

2.3 TEPs在NSCLC标志物探索中的作用 SOL等［10］差异分析了TEPs 与正常受试者中的非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）识别了差异表达的20 个具有肿瘤特异性的ncRNA，其中有16 个在TEPs 中上调表达。其中肺腺癌转移相关转录本1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）下调表达［4］，这种ncRNA 在细胞核中调节部分基因的转录，包括一些参与肿瘤转移的基因，其在多种癌组织中上调表达与肿瘤细胞的增殖转移有关［28-29］。生长阻滞特异性转录本5（growth arreth specific transcript 5，GAS5）也是下调表达的ncRNA，其参与细胞增殖，其下调表达在黑色素瘤中具有促癌作用［30］。

PUCCI 等［13］发现在KRAS 驱动的肺腺癌遗传模型中，血小板因子4（platelet factor 4，PF4）这种内分泌因子的过量产生促进了骨髓巨核细胞造血，增加了血小板在肺部的聚集并且加速了新生腺癌的发生；并且抗血小板治疗可控制小鼠肺癌的进展。这些结果提示血小板可调节肿瘤微环境，影响肿瘤的生长，PF4 作为一种促癌内分泌信号，可能作为抗癌治疗的分子靶点。

薛琳琳等［31］在156 例肺癌患者和58 例健康受试者中检测到凋亡染色体凝聚诱导因子1（apoptotic chromatin condensation inducer 1，ACIN1）在肺癌患者血小板中的表达水平显著高于健康受试者，检测其表达水平对肺癌的诊断有潜在的临床价值。ACIN1 是剪接依赖的多蛋白外显子连接复合物的一个组成部分，直接参与剪接相关的RNA代谢，可能参与了肺癌相关的TEPs 形成。

3 进展及展望

近年来，关于液体活检的研究显著增加，未来可能利用液体活检来检测、诊断和监测肿瘤，并为临床肿瘤患者个体化精准诊疗提供决策。相较于其他液体活检来源，TEPs具有丰度高、易分离、易储存、易检测的优势，并且其中的RNA 受到血小板的保护［3］。由于无诱因静脉血栓栓塞患者5%～10%的概率在事件发生后1年内被诊断为肿瘤［10］，目前有一项正在进行的临床研究（https：//www.clinicaltrials.gov/，NCT02739867），主要目标为评价血小板RNA 图谱在无诱因静脉血栓栓塞患者隐匿性癌检测中的诊断准确性，次要目标包括评价其他肿瘤生物标志物，预测出血和静脉血栓复发风险，届时可以初步验证出TEPs 是否具有用于肿瘤诊断的能力。

TEPs 的研究进展迅速，也取得了振奋人心的结果，但是TEPs 在临床诊断应用有以下局限性：无法评估肿瘤的基因组、转录组及蛋白质组学特征；无法检测肿瘤突变负荷；无法进行细胞功能学实验。由于特征和标志物的组织特异度，在其他液体活检来源中发现的生物标志物不一定能推广应用到TEPs 中，并且同一种生物标志物在不同的液体活检来源之间的诊断效果也不同，因此稳健的应用于TEPs 的标志物需要不断探索及验证。目前TEPs 在NSCLC领域的研究较为深入，但在临床上推广应用仍需回答以下问题［32］：（1）其他研究者能否重复研究结果；（2）能否将分析过程简化以便应用，例如集中于对特定的RNA 子集的分析而不降低准确性；（3）非肿瘤患者的血小板RNA 因年龄或各种非恶性疾病的变化；（4）在TEPs 达到可以检出肿瘤的阈值时肿瘤细胞的多少；（5）TEPs 能否稳健地检出其他罕见突变。为了解决这些问题，各算法需要进一步验证及改进，并且需要尽可能地研究探索NSCLC 与血小板、与TEPs 的RNA 谱改变的生物机制和病理生理效应的关系。

目前尚未研究出敏感度高、特异度高、重复性好、检测快的理想液体活检方式，各液体活检来源或方式在临床应用上各有千秋。ctDNA 可用于肿瘤的点突变、结构变异、拷贝数变异、差异ctDNA 长度和甲基化状态的检测［18］，EVs中储存着不同长度的蛋白质和RNA生物标志物分子，其表面有与肿瘤转移的器官特异性相关的表面膜蛋白［33］。COHEN等［34］开发了血液中cfDNA和蛋白质特异性标记物组合的检验CancerSEEK，其能以69%～98%的敏感度，＞99%的特异度区分未发生远处转移的癌症患者（目前不具备筛查检测卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、食管癌的功能）和健康受试者，这也提示多种液体活检来源的联合分析可促进肿瘤的早期诊断。

对于NSCLC，使用基于二代测序技术的液体活检筛查早期NSCLC，随着敏感性的增加，假阳性结果的风险增加［35］，在筛查结果呈阳性但无影像学异常的情况下，临床医师应采取行动还是随访，将是未来需要解决的挑战［36］。目前影像学检查仍是肺癌早期诊断的主要手段，将低剂量CT 筛查与基于二代测序的液体活检相结合，有望更早发现肺癌。

对各液体活检来源分析流程标准化，寻找各疾病的新型液体活检标志物并建立数据库，联合不同的液体活检来源进行分析，以期通过液体活检早期筛查、发现肺癌，提供NSCLC 的分期信息、个体治疗的靶点及疗效预测，以及进行疾病的监测和尽早发现疾病复发。TEPs 的发现及研究扩充了液体活检的途径，为肿瘤尤其是NSCLC 的诊疗提供了展望，进一步在临床的实践、研究中检验不同标志物的适用范围及效能，对将来疾病诊疗具有重要价值。