肺部微生态与肺癌相关研究进展及展望

黄丹辉 何静 董航明 蔡绍曦

南方医科大学南方医院呼吸与危重症医学科，慢性气道疾病研究所（广州510515）

在我国，肺癌死亡人数居所有恶性肿瘤的第一位［1］。2015年我国肺癌的发病数及死亡数分别达到733 300 例和610 200 例［1］。如何早期诊断以及治疗肺癌是目前临床关注的热点。人体微生态是指在一定空间范围内，细菌、真菌、病毒形成的微生物群落以其宿主的组织和细胞及其代谢产物为环境而形成的能独立进行物质、能量及基因相互交换的统一生物系统［2］。既往研究［3］表明肺部是无菌的，但随着二代测序技术的发展，研究证实在健康状态下肺部也存在丰富的细菌微生物群落。肺部微生态与呼吸系统疾病的研究为目前研究热点。然而目前研究方向主要集中与肺部细菌微生态与慢性气道疾病，如慢性阻塞性肺疾病、哮喘。关于肺部细菌微生态与肺癌的相关研究相对较少。目前研究初步探讨了肺部细菌微生态与肺癌相关性以及可能的机制。研究证实与健康人相比，肺癌患者的肺部微生态会发生结构以及个别菌属相对丰度的改变。肺部微生物可能通过菌群失调、炎症反应、代谢产物、基因毒性、免疫反应等方面影响肺癌发生发展。这些研究从肺部微生物与肺癌相互作用角度研究肺癌的机制，为临床上诊断与治疗肺癌提供新的思路。现将目前关于肺部细菌微生态与肺癌相关研究进行综述，并对今后的研究提出展望。

1 健康人肺部微生态

虽然肺部与外界空气相通，但在过去很长一段时间健康人的肺部却被看做一个无菌环境。在二十一世纪的第一个十年中，随着非培养的微生物鉴定技术的出现，人类对人体各器官的微生物组探索与日俱增［4］。2010年，HILTY 等［3］利用16S rRNA 测序技术对健康人、慢性阻塞性病例、哮喘病例的支气管镜刷检样本进行测序，结果证实健康人呼吸道含有丰富菌群。此外该研究还发现慢性气道疾病的肺部菌群有所改变。此后几年越来越多的研究利用二代测序技术证实了健康人肺部微生态的存在［4］。多项研究显示肺部菌群主要来源于上呼吸道［5-7］。儿童的肺部菌群主要来源于口咽部及鼻咽部［5］，而成人肺部菌群则主要来源于口咽部［6］。肺部菌群来源在成人及儿童存在差异的原因可能是儿童及成人上呼吸道解剖结构存在差异以及儿童鼻咽部较多的分泌物有关［8］。成人呼吸道菌群主要由包括链球菌属和韦永氏球菌属在内的厚壁菌门以及包括普氏菌属在内的拟杆菌门组成［9-11］。虽然从主气管到各级支气管存在氧分压、温度、pH 等一系列环境梯度变化，但是研究显示微生态菌群结构在健康人肺部的不同区域间是相对均匀的［11］。基于此，DICKSON 等［11］提出了改进的肺部生物地理岛屿模型。该模型提出，在健康肺中，呼吸道是从上呼吸道到肺泡延伸的相对均匀的单一生态系统，肺部某一区域的微生态群落主要由上呼吸道细菌的迁入速度以及肺部对细菌的清除速度两个因素决定，而细菌的繁殖率影响较小。综上所述，健康人肺部细菌微生态主要由口咽部常见菌群构成，细菌相对丰度主要受到迁入速度及清除速度两大因素影响。未来需要更大样本量的研究，明确健康人细菌微生态各个菌属的构成，以及年龄、性别、吸烟等因素是否会影响细菌微生态结构。

2 肺部微生态与肺癌相关性研究

研究显示在肺癌患者存在相似的肺部微生态。对216 例肺癌患者的支气管肺泡灌洗液样本的回顾性分析发现流感嗜血杆菌、肠杆菌属和埃希氏杆菌属等革兰氏阴性菌在肺癌患者中定植［12］。APOPA 等［13］对肺活检组织的微生态构成进行研究，发现肺癌患者有相似的微生态构成，以拟杆菌门和变形菌门为主，包括无色菌属、不动杆菌属、放线菌属、伊丽莎白菌属、罗氏菌属和鞘氨醇杆菌属等；同时，库克菌属、假单胞菌属、链球菌属和葡萄球菌属等机会致病菌也在肺癌患者中广泛存在。但与健康人群对比，肺癌人群的肺部微生态结构有显著差异。通过对比健康人群和肺癌组织的微生态组成，研究［14-16］发现恶性肿瘤组织菌群的α多样性明显低于对照组。一项纳入143 例肺癌患者肺癌组织、144 例肺癌邻近正常肺组织以及33 例无肺部疾病的尸体活检标本的研究显示肺癌组织与肺癌邻近组织、健康人肺组织相比，肺癌患者的肺部微生态结构存在显著差异［17］。小样本的研究也显示与健康人相比，肺癌患者痰液中的菌群结构均存在显著差异［16］。因此，目前研究说明肺癌患者肺部细菌群落结构会出现改变。但未来需要更大样本量的研究进一步证实。

许多研究在肺癌患者中检测到多个相对丰度显著改变的气道菌属，说明可能存在参与肺癌发生发展的关键菌属。LIU 等［18］采集了24 例肺癌患者病变部位和病变对侧健康部位的支气管镜刷检样本，结果显示健康人-肺癌非病变部位-肺癌病变部位中链球菌属和奈瑟菌属丰度呈升高趋势，而葡萄球菌属和小杆菌属则呈现降低趋势。在中国燃煤暴露地区不吸烟女性肺癌患者中，肺癌患者痰液中颗粒链球菌属、营养缺陷菌属和链球菌属丰度较健康对照人群明显增高［16］。一项小型基于宏基因组技术的对照研究发现肺癌患者较非肺癌患者痰液中草绿色链球菌、毗邻颗粒链球菌、结核分枝杆菌丰度升高［14］。而另一项以肺癌支气管刷检组织为样本的小型研究发现链球菌属、韦永氏球菌属和乳酸杆菌属在肺癌样本中丰度升高［15］。综上所述，肺癌患者中会出现多个菌属相对丰度的改变。由于目前大多数研究的样本量较少，而且肺癌本身异质性的存在，使得目前各个研究得到的一致性结论不多。但结合目前的研究，链球菌属可能是肺癌的关键菌属之一。目前已有4 项微生态研究发现链球菌属在肺癌患者呼吸道中显著升高［14-16，18］。大型回顾性研究证实肺炎链球菌感染可能是肺癌的危险因素［19］。基础实验证实肺炎链球菌可通过Toll 样受体2上调IL-6的表达，进而促进肺癌细胞转移［20］。但由于目前有关肺部微生态与肺癌相关性的研究均为横断面研究，无法明确肺癌与肺炎链球菌的因果关系。如肺癌患者常合并阻塞性肺炎，而研究发现肺炎链球菌是阻塞性肺炎的常见病原菌［21］。考虑肺炎链球菌是社区获得性肺炎最常见病原菌，因此迫切需要更多的研究炎症肺炎链球菌与肺癌的相关性。除了肺炎链球菌外，颗粒链球菌也可能是肺癌的关键菌属之一。颗粒链球菌与肺炎链球菌同属于乳酸杆菌目，为厌氧菌［22］。目前研究证实颗粒链球菌属在肺癌患者呼吸道中显著升高［14，16］，其中颗粒链球菌可能通过参与腐胺及聚胺的代谢途径影响肺癌［14］。

此外气道细菌微生态差异还存在于不同病理类型、不同分期以及不同突变基因的肺癌，然而目前相关研究较少。研究发现与肺鳞癌组织相比，肺腺癌组织栖热菌属相对丰度更高，罗尔通菌属相对丰度降低，并有更丰富的α多样性［23］。GREATHOUSE等［17］发现肺鳞癌患者与肺腺癌患者拥有相似的菌群结构，但肺鳞癌患者有更高丰度的食酸菌属、克雷伯菌属、单胞菌属、红育菌属。鳞癌与腺癌之间的差异可能与吸烟因素有关，与从未吸烟的肺癌患者相比，食酸菌属在吸烟患者的相对丰度更高［17］。不同分期的肺癌也存在肺部细菌差异。研究分析了癌旁组织的微生态构成，发现不同分期的肺癌β多样性（群落间的物种多样性）有显著差异，其中ⅢB 期及Ⅳ期患者栖热菌属相对丰度增高［23］。此外基础实验研究发现肺部副流感嗜血杆菌以及肺部菌群失衡可促进小鼠癌细胞转移到肺部［24-25］。这间接说明了肺部细菌可能参与了肺癌的转移。TP53 是肺癌最常见的突变基因［26］。TP53 突变可以造成气道上皮屏障的破坏［27］，进而可能对肺部菌群造成影响，更利于细菌侵入与繁殖。GREATHOUSE 等［17］发现，食酸菌属在具有TP53 突变的肺鳞癌组织中的丰度较TP53 野生型肺鳞癌显著升高。因此，肺部细菌与宿主之间可能存在复杂的相互作用。肺部细菌既可能可以促进肺癌发生发展，而宿主因素例如吸烟状态、基因突变又可能反过来影响肺部细菌，交织成复杂的关系网络。

3 肺部微生态影响肺癌发生发展的机制

目前关于细菌微生态与癌症相关机制的研究主要集中于肠道菌群与结肠癌领域。GAO 等［28］总结归纳了发表的关于消化道菌群与结肠癌机制研究的结果，指出消化道菌群主要通过菌群失调、炎症反应、代谢产物、基因毒性、免疫反应等方面影响结肠癌的发生发展。而关于肺部菌群与肺癌相关的机制研究较少。

一项大型的病例对照研究提示反复使用青霉素类药物、头孢类药物、大环内酯类药物会增加肺癌患病风险［29］，提示肺部菌群失衡可能与肺癌相关。而一项基础研究显示，在给小鼠雾化吸入万古霉素/新霉素后，小鼠B16 黑色素瘤细胞肺转移减少。而在将抗生素处理后的小鼠肺泡灌洗液移植到未处理小鼠，也能观察到B16 细胞肺转移减少的现象［30］。菌群失衡表示某些致病细菌丰度的失调，进而可能通过产生过多的毒性物质、介导炎症反应而促进肺癌发生发展。

肺部细菌的代谢产物可能参与了肺癌的发生发展。颗粒链菌属在CAMERON 等［14］的研究中被发现与肺癌相关，而功能分析发现颗粒链球菌属参与了腐胺及聚胺的代谢途径。而腐胺及聚胺的降解可以影响细胞周期，并被证实与包括肺癌在内的多种癌症相关［31］。APOPA 等［13］发现与肺鳞癌及癌旁正常组织相比，肺腺癌患者中蓝藻菌属相对丰度显著升高，而功能分析提示蓝藻菌属分泌的微囊澡素可能与聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1（PARP1）的升高相关；进一步的细胞实验证实微囊澡素刺激A427 细胞系会引起PARP1 的升高。PARP1 的表达被证实与细胞的分化及致癌作用相关［32］。

炎症、癌症、细菌有着千丝万缕的联系。近来越来越多分子机制研究显示慢性炎症在癌症发生方面发挥了重要的作用［33］。肺部细菌在招募肺泡巨噬细胞、调节T 细胞、PD-L1 介导的耐受性树突状细胞发挥作用［34］。DICKSON 等［35］研究显示相比于肠道菌群，健康小鼠的肺部菌群更能反应小鼠的肺部免疫状态。这提示肺部菌群可以通过炎症反应促进肺癌发生发展，而最近的研究支持了这一猜想。JUNGNICKEL 等［36］研究发现将注射LCC 细胞的小鼠先后暴露与烟草及副流感嗜血杆菌后，暴露于副流感嗜血杆菌组的小鼠的肺转移结节数量及体积均较未暴露组小鼠增多及增大；进一步研究显示副流感嗜血杆菌通过Toll 样受体2/4 上调IL-17C 的表达，进而诱导肿瘤周围中性粒细胞的浸润，从而促进肿瘤发展。另一篇类似的研究显示烟雾暴露导致小鼠的气道上皮完整性受损，而在气道上皮屏障受损基础上副流感嗜血杆菌易由气道上皮移位至肺癌组织，进而通过上调IL-17A 的表达量促进肿瘤周围中性粒细胞的浸润［37］。以上两个研究均说明在上皮屏障破坏的基础上，副流感嗜血杆菌通过调节炎症反应促进肺癌发生发展。众所周知，慢阻肺是肺癌公认的危险因素，而许多研究认为慢阻肺可通过气道炎症反应促进肺癌发生［38］。副流感嗜血杆菌作为慢性阻塞性肺疾病患者常见致病菌，可能起到了慢性阻塞性肺疾病与肺癌之间联系的桥梁作用。GOWING 等［20］的研究显示肺炎链球菌通过Toll 样受体2 上调IL-6 的表达，进而增强H59 和A549 非小细胞肺癌细胞的基质粘附性以及增加肺癌细胞对C57BL/6 小鼠肝窦粘附性。SUN 等［39］的研究发现肺癌合并阴性杆菌感染通常预示着肺癌术后短时间内复发；进一步研究显示将人源性非小细胞肺癌细胞给予大肠埃希菌刺激后，细胞CD133、CD44、CD166 以及ALDH1A1 等肿瘤干细胞相关标记物的表达上调，而这一作用依赖于Toll 样受体4/IL-33 信号通路。以上研究初步说明肺部细菌可通过作用于细菌模式识别受体上调炎症介质的表达，进而影响肺癌发生发展。但是细菌代谢产物、免疫系统在其中发挥的作用仍有待发掘。因此未来需要从免疫系统、细菌代谢产物、宿主基因等多角度深入立体地探讨肺部细菌与肺癌相互作用机制。

4 肺部微生态与肺癌研究展望

肺部微生态与肺癌的相关研究目前仍处于初步阶段，仍面临许多机遇和挑战。

第一，目前缺乏足够样本量的关于肺部微生态与肺癌的研究。考虑肺癌本身的异质性，以及研究中存在的种族、年龄、性别、吸烟状态、抗生素使用情况、合并的呼吸系统疾病等众多混杂因素，需要更大样本量的研究才能有足够的统计检验力说明肺部微生态与肺癌的相关性［40］。

第二，目前的研究利用不同的样本（痰液、肺泡灌洗液、支气管刷检组织、外科手术切除组织）研究肺癌病人的肺部微生态，但不同样本之间的异质性大。一项比较囊性纤维化病人自发痰液与移植肺组织微生态的研究显示痰液内的主要菌属的相对丰度与移植肺组织相似，但少见菌属的相对丰度明显与移植肺组织不同，而且多样性水平更高［41］。另一项研究比较了慢性阻塞性肺疾病患者的诱导痰液、支气管镜抽吸痰、支气管灌洗液、支气管刷检组织以及口腔标本，结果显示诱导痰、支气管镜抽吸痰、支气管灌洗液、支气管刷组织的微生态结构与口腔标本显著不同，诱导痰与支气管抽吸痰菌群结构类似，而支气管灌洗液与支气管刷组织的菌群结构类似［42］。而目前没有研究结果表明肺癌患者不同标本类型的区别以及哪些标本符合肺癌患者肺部真实微生态结构，因此无法有效整合不同标本得到的结果。将来需要在肺癌患者及健康人中开展比较不同标本类型的菌群结构的研究。除了标本类型存在异质性，样本的采集方法、核酸提取方法、测序平台及技术、生物信息学方法均存在异质性，而未来需要建立统一的标准［43］。

第三，健康人肺部菌群负荷量小，而下呼吸道与上呼吸道相通，除了手术切除肺部组织不受到上呼吸道菌群污染外，痰液、支气管灌洗液及支气管刷检产物不可避免地受到上呼吸道菌群污染，影响到结果的准确性。但是目前缺乏统一的统计学及生物信息学方法排除上呼吸道的污染［43］。

第四，将来的研究方向需要更快速准确地挖掘气道菌群与宿主之间的作用机制，而多组学的整合将带来更丰富更准确的信息。例如TSAY等［15］将微生态组学与转录组学的结果相整合，发现链球菌属与韦荣氏球菌属在肺癌人群中相对丰度较高且与ERK 和PI3K 信号通路相关，并且在细胞实验上进行了验证。ZHAO 等［44］描述了将微生物组学与转录组学整合的算法框架，并期望将来能有更多的研究利用多组学整合方法。

第五，未来需要更多的研究证实肺部微生态与肺癌的因果关系。一方面，目前开展的临床研究均为横断面研究，未来还需进一步开展前瞻性队列研究，以此证明肺部微生态与肺癌的因果关系。另一方面，将来的研究需证明干预肺部微生态可以治疗或预防肺癌的发生发展。研究发现利用抗生素干扰小鼠肠道菌群会影响小鼠肺部γδ17细胞，进而促进小鼠肺转移癌的生长［45］。但文章没有揭示肺部微生态的变化是否影响肺部免疫状态。目前粪菌移植是临床上治疗肠易激综合征、克罗恩病的新兴技术，且已显示出一定的疗效［46］。借鉴于粪菌移植概念，YADAVA 等［47］通过经鼻向小鼠气道内滴入脂多糖及弹性蛋白酶造成气道慢性炎症，发现小鼠肺部菌群结构的变化与气道炎症反应相关；而将病鼠的肺泡灌洗液经鼻滴入经过抗生素处理的小鼠气道内后小鼠气道IL-17A 水平增高。目前并没有直接通过肺部菌群移植干预肺部菌群，进而影响肺癌发生、发展的研究。

5 结语

肺癌疾病负担严重，而肺部微生态的研究从新的角度认识肺癌。目前不少研究已证实与健康人相比，肺癌患者存在肺部微生态的改变，并且肺癌患者肺部存在许多差异菌属，而这些差异菌可能通过炎症反应、产生毒性代谢产物等机制影响肺癌的发生发展。这些研究提示肺部细菌微生态很有可能参与了肺癌的发生发展。正如幽门螺旋杆菌与胃癌，乙肝病毒与肝癌的关系，笔者希望通过微生态的研究在未来能发现与肺癌相关的微生物。为实现这一目标，未来需要更多大样本、更加深入的研究探讨肺部微生态与肺癌相关性，证明肺部微生态与肺癌发生发展的因果关系；同时也需要对从标本采集、测序、数据分析等一系列过程进行标准化。最终为临床上诊断与治疗肺癌提供新的思路。