鸡大肠杆菌的分离与鉴定

2019-02-12才兴蔓

兽医导刊 2019年4期

关键词：肉汤浊度琼脂

才兴蔓

（辽宁省葫芦岛市龙港区双树动物卫生监督所，辽宁葫芦岛 125101）

1 分离实验部分

1.1 材料

（1）病料来源

某肉种鸡场30周龄罗斯308种鸡10只。无菌条件下剖检取病鸡的心、肝、脾、肾等实质脏器3份，置冰箱4℃保存，备用。

（2）培养基

普通营养肉汤、普通营养琼脂平板、兔鲜血营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板、伊红美琼脂平板、三糖铁琼脂斜面、半固体营养琼脂均按常规方法[9、10、11]自行配制。

（3）微量发酵管

糖微量发酵管由杭州天和微生物试剂有限公司提供。

（4）药敏试纸

药敏试纸由杭州天和微生物试剂有限公司提供。

（5）抗O因子血清

大肠杆菌标准O1、O2、O35、O78血清型均购自扬州大学农业部畜禽传染病学重点实验室。

（6）实验动物

小白鼠由辽宁医学院实验动物中心提供，每只体重约20g，31周龄罗斯308肉种鸡由大连庄河金泉种禽繁育有限公司提供，每只体重约3kg。

（7）主要仪器与设备

JP-A型架盘天平、自动立式电热蒸气压力消毒器（YX-350型）、DHG-9245A型电热恒温鼓风干燥箱、打孔器恒温箱、净化台（超净工作台SW-CJ-IF型）、0.5号麦氏单位胶乳浊度比浊管新华一号定性滤纸、显微镜、染缸、可调式微量移液器、玻璃仪器。

1.2 方法

（1）病料的采集

在剖检病鸡时无菌取病鸡的心、肝、脾、肾等实质脏器3份，置冰箱4℃保存，备用。

（2）细菌的分离培养

①平板划线分离培养细菌的分离培养方法有划线法和倾注法两种，本实验采用划线法。无菌条件下将病料分别接种于普通肉汤37℃培养24h后，接种于麦康凯琼脂平板，继续培养24h。

②细菌的纯化观察麦康凯琼脂平板上分离培养的菌落，选纯红色典型菌落，标记后，接种营养肉汤进行纯培养，24h后接种普通营养琼脂斜面，进一步接种伊红美兰琼脂、SS琼脂、血液琼脂平板37℃培养24h。

（3）细菌的形态学观察

细菌标本片制作的基本步骤：触片→干燥→固定→染色→镜检。

（4）生化试验

取细菌纯培养物接种五种糖类微量发酵管（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管），置37℃培养48h后进行观察。并按常规方法接种三糖铁琼脂斜面和进行吲哚试验、M-R试验、V-P试验、半固体营养琼脂穿刺试验并观察试验结果。

（5）药物敏感试验

①菌液准备钓取麦康凯琼脂培养基上单个菌落，接种于普通肉汤，37℃ 培养l0h，其浊度相当于0.5号麦氏标准，此时肉汤中活菌数为1X108CFU/mL。如肉汤中细菌浊度超过0.5号麦氏标准，用无菌生理盐水或营养肉汤稀释至0.5号麦氏标准相同的浊度。

②接种平板用无菌棉签吸取调节好浓度的菌液，在营养琼脂平板表面涂抹接种，务必将细菌菌液涂布均匀。

③在琼脂平板上贴加抗菌药敏片用灭菌尖头镊子夹取各种抗菌药药敏纸片，按一定密度分别贴到上述已涂布细菌的培养基表面，用镊子清压，确保药敏纸片与琼脂表面完全接触.纸片贴完15 min后将平板翻转过来，底部在上，置37℃ 恒温箱内培养l8h，取出观察，记录结果。

（6）分离血清型鉴定

挑取纯培养的菌落接种于液体（处理过的肉汤）培养基，37%培养12h后煮沸2h，经500Or/min，弃去上清，加入生理盐水作适度稀释。用一张清洁的玻板，取标准抗“O”单因的凝集现象。同时用生理盐水代替血清做对照组。

2 实验结果鉴定部分

2.1 细菌分离培养

在营养琼脂上37℃培养24～48h后，形成中等大小、圆形微凸起、表面光滑湿润、半透明灰白色菌落；在麦康凯琼脂上形成中等大小，表面光滑湿润的砖红色菌落；在伊红美蓝琼脂上形成紫黑色带金属光泽的菌落；在SS琼脂上生长较差呈红色；在血液琼脂上出现菌落较大，有粘性边缘整齐、并有隆起的灰白色菌落，呈完全溶血；分离菌在肉汤中培养18～24 h，呈均匀混浊，管底有淡白色粘稠沉淀，部分菌株可在肉汤表面形成菌环。