黄芩素和汉黄芩素联合应用对恩替卡韦耐药乙型肝炎病毒的抑制作用及最佳配比观察

思兰兰，李乐，陈容娟，柏兆方，牛明，王伽伯，兰金初，徐东平，刘妍

(1 中国人民解放军总医院第五医学中心，北京100039；2 北京市鼓楼中医医院)

乙型肝炎病毒(HBV)感染相关疾病严重危害人类健康，持续病毒复制增加了肝硬化和肝癌的风险。目前临床上治疗HBV感染的药物主要有干扰素和核苷(酸)类似物(NAs)。这些药物给患者带来益处的同时也存在局限性。研究[1]显示，干扰素需要注射，副作用大且仅有约30%的乙肝患者对其敏感。临床上广泛应用的口服抗病毒药NAs不能清除HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)[2]，因此需要长期服药，而随之产生的病毒耐药问题也是当前困扰临床的难题[3]。研究者一直在努力探索更多安全有效的抗HBV药物和方法，除了开发更新型的化学药物，许多中草药也被发现具有抗HBV作用[4～6]。这些中草药中含有的化学结构类型包括黄酮类、苯丙素类、萜类、生物碱、醌类和多糖等，与目前临床上应用的以NAs为主的抗HBV药物的单一结构类型相比，更具多样性，抗病毒的机制也各不相同，这不仅有助于开发抗HBV新药，并且对发展联合用药、提高疗效、减小副作用和耐药突变的发生都有重要意义[7,8]。本课题组前期研究[9,10]表明，新型中药复方制剂肃毒星可通过多分子、多靶点、多通路的方式抑制HBV复制。肃毒星的成分分析显示，其含有氧化苦参碱、苦参碱、黄芩素、汉黄芩素等25种主要成分，其中黄芩素和汉黄芩素单独使用及联合使用都有很好的抗野生HBV和恩替卡韦(ETV)耐药HBV的作用。本研究观察了黄芩素、汉黄芩素及其联合应用对ETV耐药HBV的抑制作用及最佳配比，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 黄芩素、汉黄芩素药物浓度选择及细胞分组 采用CCK8法观察黄芩素、汉黄芩素对ETV耐药HBV的毒性作用。将对数生长期的HepG2.A64细胞[11]以每孔2×104个接种于96孔板，在37 ℃、5%CO2条件下培养24 h，分别单独加入不同浓度的黄芩素(0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μmol/L)和汉黄芩素(0.75、1.5、3、6、12、24、48、96、192、384 μmol/L)，记为实验组。隔天换液1次，继续培养96 h后，每孔加入10 μL CCK8溶液继续培养2 h。以空白孔为空白组，以不加药物的孔为对照组，酶联免疫检测仪检测在波长450 nm处各孔的吸光度(OD)值，计算细胞存活率。细胞存活率=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。结果显示，黄芩素在16 μmol/L、汉黄芩素在12 μmol/L时的细胞存活率大于90%，故本研究选择黄芩素的最高浓度为16 μmol/L、汉黄芩素的最高浓度为12 μmol/L进行后续实验。

取HepG2.A64细胞，分为黄芩素组、汉黄芩素组、联用药物组和对照组。黄芩素组分别加入4、8、16 μmol/L的黄芩素，记为B4、B8、B16组。汉黄芩素组分别加入3、6、12 μmol/L的汉黄芩素，记为W3、W6、W12组。联用药物组的第一部分分别加入相同浓度(4 μmol/L)的黄芩素及不同浓度(3、6、12 μmol/L)的汉黄芩素，记为B4+W3、B4+W6、B4+W12组；联用药物组的第二部分分别加入相同浓度(8 μmol/L)的黄芩素及不同浓度(3、6、12 μmol/L)的汉黄芩素，记为B8+W3、B8+W6、B8+W12组；联用药物组的第三部分分别加入相同浓度(16 μmol/L)的黄芩素及不同浓度(3、6、12 μmol/L)的汉黄芩素，记为B16+W3、B16+W6、B16+W12组。对照组加入等量DMEM培养基。

1.2 各组细胞上清HBV DNA、HBsAg检测 取各组细胞以0.5×105/孔铺种于48孔板，继续培养96 h后，收集细胞上清。①采用PCR-荧光探针“一管法”检测细胞上清HBV DNA。按照乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒说明书进行定量PCR反应体系配制：细胞上清3 μL+核酸释放剂3 μL+PCR-mix 32 μL，吹打混匀3～5次，瞬时离心，然后使用SLAN96P荧光定量检测仪定量检测HBV DNA滴度。扩增程序为：37 ℃ 2 min，95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s、61 ℃ 30s，40个循环。根据检测结果计算细胞上清HBV DNA抑制率。细胞上清HBV DNA抑制率=100%-(各组细胞上清HBV DNA滴度/对照组细胞上清HBV DNA滴度)×100%。②采用双抗体夹心法检测细胞上清HBsAg。取细胞上清50 μL，加入预先包被好的酶联板，实验同时设置空白对照孔、阴性对照孔、阳性对照孔，每孔分别加入酶结合物50 μL(空白对照孔不加)混匀，贴上不干胶条，37 ℃孵育60 min，洗板5次，然后加入显色液，37 ℃孵育15 min显色，最后加入终止液终止显色反应，使用Synergy H4全功能酶标仪在450 nm波长处检测各孔吸光度(OD)值，计算细胞上清HBsAg抑制率。细胞上清HBsAg抑制率=100%-(各组细胞上清HBsAg的OD值/对照组细胞上清HBsAg的OD值)×100%。

1.3 各组细胞内HBV总DNA和HBV cccDNA的检测 取各组细胞以1.5×105/孔铺种于12孔板，继续培养96 h后，收集培养的细胞进行计数，收集时每孔细胞计数需要达到3×105～5×105个。按照QIAamp DNA Mini Kit试剂盒说明书提取细胞总DNA，PSAD酶消化，按照95 ℃ 3 min、50 ℃ 15 s、30 ℃ 15 s、20 ℃ 10 min的程序进行跨缺口滚环扩增(RCA)[12]。引物序列如下：RCA1正向引物为5′-AATCCTCACAATACC-3′，RCA1反向引物为5′-ACCTATTCTCCTCCC-3′；RCA2正向引物为5′-CCTATGGGAGTGGGC-3′，RCA2反向引物为5′-CCTTTGTCCAAGGGC-3′；RCA3正向引物为5′-ATGCAAC TTTTTCAC-3′，RCA3反向引物为5′-CTAGCAGAGCTTGGT-3′；RCA4正向引物为5′-TAGAAGAAGAACTCC-3′，RCA4反向引物为5′-GGGCCCACATATTGT-3′。以RCA扩增产物为模板，荧光定量PCR法检测细胞内HBV总DNA、HBV cccDNA的拷贝数[13]。反应条件：60 ℃ 10 s，94 ℃ 3 min、94 ℃ 15 s、58 ℃ 45 s(40个循环)。根据细胞内HBV总DNA、HBV cccDNA的拷贝数，计算细胞内HBV总DNA抑制率。细胞内HBV总DNA抑制率=100%-(各组HBV总DNA拷贝数/对照组HBV总DNA拷贝数)×100%。细胞内HBV cccDNA抑制率=100%-(各组HBV cccDNA拷贝数/对照组HBV cccDNA拷贝数)×100%。

2 结果

2.1 各组细胞上清HBV DNA抑制率比较 B4、B8、B16、W3、W6、W12、B4+W3、B4+W6、B4+W12、B8+W3、B8+W6、B8+W12、B16+W3、B16+W6、B16+W12、对照组细胞上清HBV DNA抑制率分别为29.01%±3.60%、61.79%±0.09%、73.59%±2.65%、30.45%±1.26%、62.65%±0.05%、67.22%±3.93%、49.81%±1.36%、63.87%±4.01%、73.64%±0.29%、70.05%±1.15%、70.99%±0.42%、79.16%±1.54%、79.18%±0.53%、80.57%±1.60%、83.00%±2.31%、0。黄芩素组、汉黄芩素组、联用药物组细胞上清HBV DNA抑制率与对照组相比，P均<0.05；联用药物组细胞上清HBV DNA抑制率与相同药物浓度的黄芩素组、汉黄芩素组相比，P均<0.05。联用药物组B4+W3、B4+W6、B4+W12、B8+W3、B8+W6、B8+W12、B16+W3、B16+W6、B16+W12的Q值分别为0.884、0.869、0.960、0.954、0.828、0.905、0.970、0.894、0.909，其中B8+W6组表现为拮抗作用，其余各组均为相加作用。Q值最大的B16+W3组药物浓度为最佳的作用配比，最佳作用配比大约为5∶1。

2.2 各组细胞上清HBsAg抑制率比较 B4、B8、B16、W3、W6、W12、B4+W3、B4+W6、B4+W12、B8+W3、B8+W6、B8+W12、B16+W3、B16+W6、B16+W12、对照组细胞上清HBsAg抑制率分别为20.46%±0.92%、30.52%±6.59%、39.46%±2.63%、14.13%±2.90%、26.42%±4.74%、38.53%±1.32%、19.87%±0.13%、23.81%±1.32%、36.29%±5.01%、26.56%±1.15%、27.44%±0.66%、48.68%±3.29%、42.55%±2.30%、39.37%±1.19%、52.87%±3.42%、0。黄芩素组、汉黄芩素组、联用药物组细胞上清HBsAg抑制率与对照组相比，P均<0.05；联用药物组细胞上清HBsAg抑制率与相同药物浓度的黄芩素组、汉黄芩素组相比，其中B8+W12组与B8组、W12组相比，B16+W3组与B16组、W3组相比，B16+W12组与B16组、W12组相比，P均<0.05；其余联用药物组与相同药物浓度的黄芩素组、汉黄芩素组相比，P均>0.05。联用药物组B8+W12、B16+W3、B16+W12的Q值分别为0.850、0.886、0.842，其中B8+W12、B16+W3组为相加作用，B16+W12组为拮抗作用。Q值最大的B16+W3组药物浓度为最佳的作用配比，最佳作用配比大约为5∶1。

2.3 各组细胞内HBV总DNA抑制率比较 B4、B8、B16、W3、W6、W12、B4+W3、B4+W6、B4+W12、B8+W3、B8+W6、B8+W12、B16+W3、B16+W6、B16+W12、对照组细胞内HBV总DNA抑制率分别为28.14%±0.44%、44.89%±0.81%、58.70%±7.36%、13.50%±0.63%、43.61%±0.89%、68.08%±1.62%、37.89%±0.36%、60.41%±3.27%、67.03%±1.67%、58.94%±0.32%、64.47%±5.54%、73.68%±7.53%、76.05%±2.68%、80.47%±2.18%、87.97%±1.24%、0。黄芩素组、汉黄芩素组、联用药物组细胞内HBV总DNA抑制率与对照组相比，P均<0.05；联用药物组细胞内HBV总DNA抑制率与相同药物浓度的黄芩素组、汉黄芩素组相比，P均<0.05。联用药物组B4+W3、B4+W6、B4+W12、B8+W3、B8+W6、B8+W12、B16+W3、B16+W6、B16+W12的Q值分别为1.001、1.016、0.870、1.126、0.935、0.894、1.183、1.049、1.013，其中B16+W3组表现为协同作用，其余各组均为相加作用。Q值最大的B16+W3组药物浓度为最佳的作用配比，最佳作用配比大约为5∶1。

2.4 各组细胞内HBV cccDNA抑制率比较 B4、B8、B16、W3、W6、W12、B4+W3、B4+W6、B4+W12、B8+W3、B8+W6、B8+W12、B16+W3、B16+W6、B16+W12、对照组细胞内HBV cccDNA抑制率分别为31.06%±2.89%、47.86%±6.79%、54.67%±3.92%、43.84%±2.11%、54.84%±1.78%、68.86%±2.80%、55.00%±3.30%、31.66%±1.40%、34.05%±4.85%、65.12%±3.41%、49.39%±0.95%、44.42%±2.36%、72.42%±4.71%、68.15%±2.46%、72.05%±0.34%、0。黄芩素组、汉黄芩素组、联用药物组细胞内HBV cccDNA抑制率与对照组相比，P均<0.05；联用药物组细胞内HBV cccDNA抑制率与相同药物浓度的黄芩素组、汉黄芩素组相比，其中B16+W3组与B16组、W3组相比，B16+W6组与B16组、W6组相比，B16+W12组与B16组、W12组相比，P均<0.05；其余联用药物组与相同药物浓度的黄芩素组、汉黄芩素组相比，P均>0.05。联用药物组B16+W3、B16+W6、B16+W12的Q值分别为0.972、0.857、0.839，其中B16+W3、B16+W6组为相加作用，B16+W12组为拮抗作用。Q值最大的B16+W3组药物浓度为最佳的作用配比，最佳作用配比大约为5∶1。

3 讨论

近年来，随着抗病毒治疗技术的不断发展，联合抗病毒治疗已经成为临床常用的一种HBV治疗方案，且联合治疗显示出一定的优势。我们前期研究[10]发现，黄芩素和汉黄芩素是新型中药复方抗病毒制剂——肃毒星注射液中的两种主要组成成分，这两种化合物单独或以1∶2的比例联合应用对野生型HBV及ETV耐药HBV有很好的抑制作用。黄芩素，也叫黄芩黄素或黄芩苷元，是从黄芩根中提取的一种具有生物活性的黄酮类化合物。近年越来越多的研究[10,15]发现，黄芩素具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、保护肝脏、保护心脑血管、抗炎、抗氧化、降血糖等多种生物学功能。汉黄芩素，也是从黄芩根中分离提取出来的一种黄酮类化合物，它是黄芩的主要有效成分之一。目前已有大量研究[10,16]证明，汉黄芩素具有抗炎、抗肿瘤、抗纤维化及抗HBV作用等功能。目前这两个药物联合抗HBV的作用研究鲜见报道，同时两种化合物对ETV耐药HBV cccDNA的相关研究尚未见报道。本研究旨在明确两者联合对ETV耐药HBV作用的最佳联合比例及其对HBV cccDNA的作用效果。

本研究选择细胞存活率>90%的药物浓度进行后续实验。为了寻找最佳的联合抗病毒作用比例，我们选择4、8、16 μmol/L的黄芩素和3、6、12 μmol/L的汉黄芩素分别进行两两联合抗病毒实验。研究结果显示，黄芩素组对HBV DNA、HBsAg作用的抑制率范围分别为29.01%～73.59%、20.46%～39.46%，汉黄芩素组对HBV DNA、HBsAg作用的抑制率范围分别为30.45%～67.22%、14.13%～38.53%，联用药物组对HBV DNA、HBsAg作用的抑制率范围分别为49.81%～83.00%、19.87%～52.87%，联合抑制作用的效果更明显。Guo等[17]使用汉黄芩素对野生型HBV细胞株HepG2.2.15细胞进行研究，发现2～5 μg/mL(约7～18 μmol/L)的汉黄芩素对HBsAg的抑制率为45%～60%，对HBV DNA的抑制率为30%～40%。我们单独使用汉黄芩素对HBsAg抑制作用与之一致，对HBV DNA的抑制作用则优于Guo的研究。以往对黄芩素、汉黄芩素抗HBV研究中未见对HBV总DNA、HBV cccDNA两个指标进行过评价，本研究结果显示，联用药物组对细胞内HBV总DNA、HBV cccDNA的抑制效果较黄芩素组、汉黄芩素组好，我们的结果可为以后研究者探索这两个药物抗HBV总DNA、HBV cccDNA的作用提供很好的参考。

综上所述，中药复方制剂肃毒星的两个重要组分黄芩素、汉黄芩素对ETV耐药HBV有很好的抑制作用，且联合用药抑制作用优于单独用药。同时，我们还首次证明黄芩素、汉黄芩素对HBV cccDNA有抑制作用，且联合用药的抑制作用较单独用药的抑制作用明显。本研究结果对于强效NAs的长期应用带来的耐药问题及HBV cccDNA清除的乙肝功能性治愈有着很好的临床用药参考价值和较好的临床应用前景。