不同浓度华蟾素与吉非替尼联合应用对人非小细胞肺腺癌细胞株A549增殖、凋亡的影响及其机制

马荣辉，董春岚，韩有溪，曹国磊，罗琴

(新疆医科大学第三附属肿瘤医院，乌鲁木齐830000)

原发性肺癌是常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率均居全球恶性肿瘤首位，其中80%～85%的肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。研究[1]显示，超过半数的NSCLC患者初次诊断时即处于晚期。肺腺癌是最常见的NSCLC的组织学亚型，占50%以上[2]。研究[3]发现，表皮生长因子受体(EGFR)基因是NSCLC中发生发展过程中最重要的驱动基因之一。以吉非替尼为代表的EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)对EGFR基因突变型NSCLC疗效显著，已被作为此类患者的一线治疗药物[4]。虽然吉非替尼的临床反应良好，但许多患者在治疗10～14个月时都会出现获得性耐药，最终导致治疗失败[5]。目前针对吉非替尼耐药的NSCLC的新型靶向治疗药价格较贵，患者往往经济无法负担或精神压力较大而造成治疗受阻，因此选用合适的辅助药物提高吉非替尼对EGFR基因突变型NSCLC的敏感性、延缓耐药、延长治疗时间值得深入研究。华蟾素是我国自行研发的一种中药抗肿瘤药物，在肿瘤的协同放化疗及靶向治疗中被广泛应用[6]。研究[7～9]显示，华蟾素对多种肿瘤细胞具有抑制作用，并且已经引入到临床治疗中。本研究观察了不同浓度华蟾素联合吉非替尼对人非小细胞肺腺癌细胞株A549增殖、凋亡的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 华蟾素、细胞及试剂 华蟾素购自solarbio公司，人非小细胞肺腺癌细胞株A549由新疆医科大学第三附属医院肿瘤研究所提供，吉非替尼购自国药公司，MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自武汉巴菲尔生物技术服务有限公司，流式细胞仪CytoFLEX购自BECKMAN公司，胎牛血清购自Invitrogen公司，细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物公司，DMEM购自GIBCO公司，兔多抗GAPDH(AB-P-R001)抗体购自杭州贤至生物有限公司，兔多抗met(156KD)抗体购自Bioworld公司，HRP标记羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 细胞培养及分组 将A549细胞置于pH 7.2～7.4的含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的RPMI1640培养基中，于37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养。取处于对数生长期且生长状态良好的A549细胞，分为吉非替尼组、华蟾素组、联合药物组和对照组。吉非替尼组分别加入1、5、10、20、40 μmol/L的吉非替尼，记为A1、A2、A3、A4、A5组；华蟾素组分别加入0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 mg/mL的华蟾素，记为B1、B2、B3、B4、B5组；联合药物组分别加入1 μmol/L吉非替尼+0.005 mg/mL华蟾素、5 μmol/L吉非替尼+0.01 mg/mL华蟾素、10 μmol/L吉非替尼+0.05 mg/mL华蟾素、20 μmol/L吉非替尼+0.01 mg/mL华蟾素、40 μmol/L吉非替尼+0.5 mg/mL华蟾素，记为C1、C2、C3、C4、C5组；对照组加入等量DMSO。

1.3 各组细胞增殖能力观察 取A549细胞，调整细胞密度至5×104/mL，接入96孔板，每孔加入100 μL细胞悬液，按照“1.2”方法进行分组处理，每组设3个复孔，37 ℃条件下继续培养，在培养24、48、72 h时，加入10 μL MTT溶液继续培养4 h，吸出培养基，加入150 μL DMSO震荡10 min，以空白孔为空白组，酶标仪测定各孔在568 nm处的吸光度(OD)值，以OD值表示细胞增殖能力。实验重复3次，取平均值。

1.4 A5、B5、C5和对照组细胞凋亡率测算 采用流式细胞术。取A549细胞，以2×105/孔接种于6孔板，按照“1.2”方法进行分组处理，选取A5、B5、C5和对照组细胞，在37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养48 h，用不含EDTA的0.25%胰酶消化、收集细胞，PBS润洗2次，加入500 μL Binding Buffer重悬细胞，加入5 μL AnnexinV-FITC、5 μL PI混匀，室温避光反应5～15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 A5、B5、C5和对照组细胞c-met蛋白检测 采用Western Blotting法。取A549细胞，加入3 mL 4 ℃预冷的PBS洗去培养液，加入400 μL含PMSF(100 mmol/L)的裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 r/min离心5 min提取细胞总蛋白，BSA蛋白定量法测定蛋白浓度定量。取细胞总蛋白40 μg，加入缓冲液于沸水中煮沸10 min使蛋白变性，用微量加样器将制备好的蛋白样品和Maker加入上样孔进行电泳分离，转移至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭液浸泡，室温摇床封闭2 h，加入相应的一抗，4 ℃孵育过夜，TBST充分洗涤PVDF膜5～6次，5 min/次，加入相应的HRP标记二抗，37 ℃摇床孵育2 h，TBST洗涤PVDF膜5～6次，ECL发光试剂盒发光、显影、定影，使用BandScan分析蛋白灰度值，计算目的蛋白的相对表达量。目的蛋白的相对表达量=目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值。

2 结果

2.1 各组细胞增殖能力比较 ①A1、A2、A3、A4、A5组细胞培养24 h时的OD值分别为0.410±0.030、0.371±0.037、0.322±0.010、0.284±0.025、0.196±0.020，B1、B2、B3、B4、B5组分别为0.463±0.021、0.454±0.017、0.472±0.013、0.460±0.009、0.452±0.028,C1、C2、C3、C4、C5组分别为0.412±0.016、0.359±0.023、0.306±0.035、0.249±0.020、0.174±0.024，对照组为0.458±0.025；其中，吉非替尼组、联合药物组与对照组相比，P均<0.05；吉非替尼组、联合药物组内各浓度组间相比，P均<0.05；C2、C3、C4、C5组与相同浓度的A2、A3、A4、A5组和B2、B3、B4、B5组相比，P均<0.05。②A1、A2、A3、A4、A5组细胞培养48 h时的OD值分别为0.541±0.010、0.453±0.016、0.396±0.011、0.344±0.014、0.261±0.011,B1、B2、B3、B4、B5组分别为0.688±0.035、0.687±0.018、0.677±0.018、0.641±0.036、0.556±0.019,C1、C2、C3、C4、C5组分别为0.526±0.033、0.431±0.019、0.376±0.027、0.296±0.022、0.209±0.027,对照组为0.684±0.019；其中，吉非替尼组、B3组、B4组、B5组、联合药物组与对照组相比，P均<0.05；吉非替尼组、华蟾素组、联合药物组内各浓度组间相比，P均<0.05；联合药物组与相同浓度的吉非替尼组、华蟾素组相比，P均<0.05。③A1、A2、A3、A4、A5组细胞培养72 h时的OD值分别为0.755±0.021、0.590±0.024、0.499±0.023、0.353±0.022、0.267±0.005,B1、B2、B3、B4、B5组分别为1.088±0.176、0.990±0.085、0.849±0.038、0.758±0.050、0.704±0.041,C1、C2、C3、C4、C5组分别为0.714±0.033、0.481±0.036、0.383±0.026、0.310±0.006、0.232±0.011,对照组为1.089±0.190；吉非替尼组、华蟾素组、联合药物组与对照组相比，P均<0.05；吉非替尼组、华蟾素组、联合药物组内各浓度组间相比，P均<0.05；联合药物组与相同浓度的吉非替尼组、华蟾素组相比，P均<0.05。各组细胞培养24、48、72 h时，相同浓度组间相比，P均<0.05。

2.2 A5、B5、C5、对照组细胞凋亡率比较 A5、B5、C5、对照组细胞培养48 h时的凋亡率分别为14.37%±0.48%、9.76%±0.37%、35.01%±0.62%、4.13%±0.65%，组间相比，P均<0.01。

2.3 A5、B5、C5、对照组细胞c-met蛋白相对表达量比较 A5、B5、C5、对照组细胞中c-met蛋白的相对表达量分别为0.477±0.034、0.629±0.007、0.332±0.010、0.738±0.023，组间相比，P均<0.001。

3 讨论

目前所发现的恶性肿瘤中，肺癌患病及致死率均居第一，由于肺癌早期缺乏典型临床症状，很难做到早发现、早诊断、早治疗。据统计，进展期的肺癌5年生存率不足15%[10]。据有关文献[11]报道，2015年我国肺癌发病和死亡人数分别为73万例和61万例。在治疗肺癌期间，中草药的辅助治疗在减轻患者临床症状、改善生活质量及延长生存期方面有明显优势，并越来越多的在相关领域受到关注[12]。华蟾素主要成分为蟾素内酯，具有很强的抗癌活性，对肿瘤细胞有很强的杀伤和抑制作用。现已报道，华蟾素在肝癌[13]、前列腺癌[14]、胃癌[15]等多种癌症中可发挥抗肿瘤效果。熊飞等[16]发现，华蟾素可显著抑制裸鼠的肺癌A549移植瘤生长，与抑制肿瘤细胞生长、促进其凋亡有关。本研究发现，华蟾素单独作用于肺癌A549细胞后有明显的增殖抑制效果，并随着时间的延长而升高；在联合吉非替尼后，增值率也明显低于吉非替尼组，说明华蟾素对肺癌A549细胞是有增殖抑制作用的，且在联合吉非替尼时也起到一定的增效作用。本研究还发现，华蟾素可促进肺癌A549细胞的凋亡，在联合用药后，细胞凋亡率明显高于任一单独用药组，说明华蟾素能显著提高肺癌A549细胞对吉非替尼的敏感性，同时增强了吉非替尼的抗肿瘤活性，从而促进肺癌A549细胞凋亡。

EGFR是一种广泛表达的酪氨酸激酶生长因子受体，其在表皮生长因子介导的下游信号通路的过度表达和异常激活与各种上皮源性肿瘤的发病机制密切相关[17]。经典的EGFR信号通路主要依赖于其酪氨酸激酶活性，在EGF等配体的指导下，EGFR通过自身的二聚或与其他家族成员的相互作用而被激活。激活的EGFR通过激活Ras-Raf-MEK-ERK1/2、PI3-K-Akt-mTOR、JAK2-STAT3和PLC-γ-PKC-IKK等途径参与一系列肿瘤细胞恶性表型的调节[18]。EGFR扩增和异常激活是NSCLC常见的分子事件，因此，在NSCLC的临床治疗中应用了以EGFR为靶点的受体酪氨酸激酶抑制剂，如吉非替尼和厄洛替尼[19]。EGFR-TKIs已上市近10年，对EGFR突变的NSCLC患者具有良好的临床疗效，但频繁的耐药限制了其进一步的应用[20]。EGFR-TKIs如吉非替尼的耐药主要由于异常突变激活下游的表皮生长因子受体信号通路Ras-Raf-MEK-ERK1/2 PI3-K-Akt-mTOR,或由于继发性耐药如c-met过表达等二级EGFR基因突变,使得EGFR靶向治疗受到极大地限制[21]。c-met是肝细胞生长因子(HGF)的受体。研究[22]表明，c-met的高表达可以激活肿瘤细胞中多种信号通路，促进肿瘤的生存和生长。c-met通路是诱导肺癌细胞对吉非替尼耐药的重要机制，因此，辅助靶向治疗降低c-met过表达已成为提高抗肿瘤药物疗效的重要策略[23]。有研究[24]显示，华蟾素可以抑制HGF/c-met通路蛋白的表达，抑制荷瘤小鼠肝癌的生长。本研究表明，在c-met蛋白表达上，华蟾素单药及联合用药均可使其蛋白表达降低，其中联合用药组与吉非替尼组存在显著差异。

综上所述，与单独应用吉非替尼或华蟾素相比，华蟾素联合吉非替尼可抑制人非小细胞肺腺癌细胞株A549等增殖，促进其凋亡；华蟾素联合吉非替尼可通过下调c-met蛋白表达来发挥抗肿瘤作用。此外，因华蟾素能帮助吉非替尼降低对c-met的表达，我们推测华蟾素可在一定程度上延缓肺癌细胞对吉非替尼耐药的发生。这些研究为吉非替尼等EGFR酪氨酸激酶抑制剂的靶向治疗增效及寻求延长耐药的方法提供了新的策略和思路。