人羊膜上皮细胞治疗心肌梗死的研究进展

张臣臣 尹熙惠 杨智昉 何希彪 方成虎

1延边大学附属医院（吉林延边133000）；2上海健康医学院基础医学院（上海201318）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是冠状动脉闭塞或痉挛所致的血流供应出现急剧减少或中断时间较长，使得部分心肌因严重缺血、缺氧发生局部坏死。MI发生后，坏死的心肌不可再生，瘢痕组织将取而代之修复坏死区域的心肌细胞。随时间推移，MI患者最终会出现心室重构、心力衰竭，严重影响发病后的生存质量，甚至死亡[1]。目前临床治疗MI主要采取3种方法：静脉溶栓、经皮冠状动脉介入术、冠状动脉旁路移植术。但是上述3种治疗方法仅能在短期内缓解病情及症状，并不能从根本上修复已经受损及死亡的心肌细胞。因心肌细胞为高度分化的终末细胞，坏死后不能再生[2]，上述治疗方法对已坏死心肌无再生作用。对于医疗工作者来说寻求新的治疗MI及改善远期预后的方法，意义重大。近年来，细胞替代治疗以其极具潜力的应用前景引起了临床和基础医学工作者的关注[3-6]。其核心策略为利用患者自体或异体细胞移植入受损组织或器官，最终实现缺失部位的替代和功能的修复。

大量动物实验以及临床研究已证实移植胚胎干细胞[7]、脂肪间充质干细胞[8]、脐带血间充质干细胞[9-11]、骨髓间充质干细胞[12-14]、诱导多能干细胞[15]等能使坏死的心肌再生，这些干细胞具有来源广泛、容易体外分离、扩增等优点，但也存在如社会伦理问题、免疫排斥反应、致瘤性、疗效不确定性等不足之处[16]。因此，开发一种能解决上述不足的理想细胞来源，便成为当前细胞治疗研究的热点[17]。

人羊膜上皮细胞（human amniotic epithelial cells，hAECs）克服了以上细胞的缺点，以其广泛可用性、干细胞特性、低免疫源性、分化可塑性、无致瘤性，容易获取且不涉及伦理问题等优点[18-19]，成为细胞替代治疗MI的一个新的发展和研究热点，近10年来受到了越来越多的关注。本文将围绕hAECs在MI治疗方面的作用及其机制进行综述。

1 hAECs的来源及特性

hAECs单层分布构成了羊膜上皮，羊膜上皮与羊水直接接触，电镜下可见hAECs表面的微绒毛，使得羊水与羊膜间进行物质交换。hAECs是在受精后第8天左右由多能性上胚层分化而来，当胚囊嵌入子宫内膜间质时分为两层：原始外胚层和原始内胚层。原始外胚层随后分化为外、中、内三个胚层，并最终形成发育中的胚胎[16]。羊膜腔在原始外胚层中形成，靠近羊膜腔的细胞即为hAECs。

有学者[20-23]提出，器官的发生始于原肠胚，但是hAECs发生于原肠胚形成前，以及羊膜腔的隔离，原肠胚的器官形成信号分子可能不能完全作用于hAECs，推测其仍然保留有较多的干细胞特性。hAECs在体外培养的条件下可以表达多能干细胞标记物如OCT-4、NANOG、SOX-2等；胚胎干细胞标记物如 SSEA-3、SSEA-4、TRA 1-60、TRA1-81；以及间充质干细胞标记物CD105、CD90、CD73等[23-28]；除表达干细胞特异标记外，hAECs还有向三个胚层组织分化的潜能[29]，国内外大量研究表明可以诱导原代hAECs分化为心肌样细胞[30]、成骨样细胞[31]、胰岛样细胞[32]、肝样细胞[33]、神经样细胞[34]等。不仅如此，hAECs可获得充足的细胞数量，无致瘤性，分泌抗炎因子、防止移植后炎性反应的发生等特点[20]。

2 hAECs在MI治疗的作用

体外分化研究中，MIKI等[23]已成功将hAECs分化成三个胚层的不同细胞，其中包括中胚层的心肌样细胞，证明了hAECs向心肌细胞分化的细胞疗法的可能性。FANG等[30]将表达上皮细胞特异性标记的hAECs移植入由液氮造成的MI大鼠模型后，在1个月内能在体内分化成表达心肌细胞特异性标记MHC的心肌样细胞，通过免疫组化及分子生物学分析等实验证实，分化后的细胞有效减少了梗死面积，PET及超声心动图等实时监测分析进一步显示，心脏功能也得以部分恢复。该研究更进一步将hAECs移植与脐带血及脂肪源间充质干细胞移植的效果做了对比，结果显示hAECs能够达到与脐带血及脂肪源间充质干细胞相似的MI治疗效果。值得注意的是，移植入心脏的hAECs存活率仅有3%，且其治疗机制尚不明确，预示此移植方案仍有很大的调整和优化空间。尽管如此，在此研究中展现的较好治疗效果仍然说明，hAECs可能是心肌再生细胞治疗的极佳细胞来源。王钰莹等[35]将hAECs移植到左前降支结扎的大鼠模型中，发现hAECs移植组较MI模型组梗死区存活的心肌细胞更多，纤维化程度更小，左心室重构减轻、延缓。

基于以上研究，ROY等[28]认为hAECs较低的移植效果可能是由于hAECs本身不具有较高的移动性和合适的胞外基质导致的，所以用TGF-β1对hAECs进行了上皮间充质化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT），并将 EMT-hAECs移植入前降支结扎的MI小鼠模型。在体外hAECs培养基中加入TGF-β1培养6 d后，hAECs典型的鹅卵石样形态改变，呈成纤维细胞形状，且细胞体积增大，细胞移动性增强。通过免疫组化及分子生物学分析等实验进一步显示，与hAECs相比EMT-hAECs膜表面蛋白、分子信号传导通路、EMT特异蛋白比例、明胶酶的活性、细胞基质、细胞骨架及基因的表达样式都发生明显变化，证明了经TGF-β1诱导后的hAECs实现EMT，hAECs失去了原有的上皮细胞特征及基因表达模式。随后的MI移植实验显示，EMT-hAECs相较hAECs在移植后4周表现出更好的治疗效果，包括更高的左室射血分数，更大的心输出量与心肌形变率。病理及生化分析结果显示，EMT-hAECs处理的MI面积更小，TUNEL阳性的凋亡细胞更少，以及更多的骨膜蛋白分泌，但在心肌血管密度上与hAECs比较无差异。以上研究显示出hAECs在MI治疗方面的巨大前景。

3 hAECs在MI治疗中提高心功能的机制

在对MI大鼠模型的细胞移植中，仅有3%的hAECs转化为心肌样细胞[30]。由此可见为数不多的心肌样细胞可能并不是改善心功能的关键因素。SONG等[36]提出hAECs移植后的旁分泌机制可能在改善心功能中起到关键作用。伴随着低氧指示分子HIF1α的明显增多，hAECs分泌的诸多关键细胞因子都有明显增加，其中包括促血管生成相关因子如血管生成素（Ang）、表皮生长因子（EGF）等，以及炎症相关因子如白介素6（IL-6）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）。与体外模型结果一致，体内实验中hAECs移植区域附近的组织中编码以上细胞因子的基因转录表达水平也有显著提高，证明了hAECs介导的旁分泌通路的确在移植后发挥了正向的作用。值得注意的是，与移植1 d后的检测结果相比，一周后部分细胞因子如EGF和IL-6的表达有明显的下降，说明hAECs的旁分泌疗效持续时间较短。这也反映了hAECs用于细胞替代治疗的不足之处。优化hAECs的特性成为其继续发展另一途径。

与未修饰的hAECs移植相比，EMT-hAECs并不是通过增强血管再生或心肌细胞再生的途径来提高hAECs改善心功能的作用，而是借由减少梗死区TUNEL阳性凋亡细胞数量、促进心肌成纤维细胞分泌骨膜蛋白、激活整合素介导的局灶性粘附激酶信号以加快成纤维细胞增殖和迁移，以及促进细胞外基质（ECM）重构等分子与细胞机制，进一步缩小梗死面积。IL-8为EMT-hAECs治疗过程中增加最明显的细胞因子，其对人类心力衰竭有不良影响。但另一方面，IL-8已被证实有调节骨髓血管母细胞心肌归巢和血管生成作用。IL-8的作用仍存在争议[37]，但为靶向化治疗MI提供了科学依据。

旁分泌作为移植细胞保护心肌、提高心功能的机制之一，为hAECs移植治疗MI提供了新方向。各种干细胞衍生的外泌体通过向细胞外分泌一些蛋白质、脂质体及小RNA，在细胞及组织之间传播信息，保护心脏功能[38]，参与梗死后心脏的修复[39]。其中KHAN等[40]的研究发现胚胎干细胞来源的外泌体促进MI后新生血管的生成、提高心肌细胞存活及降低心脏纤维化的发生。其研究还发现胚胎干细胞源的外泌体作用机制是通过向心脏祖细胞传递miR-294，促进心脏祖细胞的存活及增殖，从而修复受损心肌，提高心功能。除此之外还有各种间充质干细胞[41-43]，其衍生的外泌体有同样的功效。值得注意的是不同干细胞，其外泌体包含的成分及其作用机制各不相同。hAECs在移植到梗死心肌后，心功能较移植前提高，是否与其外泌体机制有关，值得进一步研究。

4 hAECs在MI治疗的临床运用及前景

目前用于MI细胞替代治疗的临床试验方式有如下3种：经冠状动脉注射、心肌内注射、静脉注射。经冠状动脉注射在临床试验研究中最常见，即直接将干细胞注射到冠状动脉。在YANG等[44]的临床试验中，16例前壁心肌梗死的患者行经皮冠状动脉介入术3周后，随机将骨髓间充质干细胞经左前降支或右冠状动脉注入。6个月后，随访发现患者心功能较移植前有明显改善。但此移植方式仍存在不足，经冠状动脉注射在治疗过程中可能引起短暂的冠状动脉血流减少、远端心肌缺血，甚至可能造成微循环堵塞导致新的心肌梗死。心肌内注射的方式，即将细胞直接注射到病灶处，最大程度的保证靶部位移植细胞的数量，但其操作步骤复杂且存在心脏穿孔、血栓栓塞及恶性心律失常的风险[45]。静脉注射，即将移植细胞直接注入到静脉中，移植细胞经血液循环到达靶器官，此方法虽操作简单，但其致命缺点决定了此种方式移植效率最差。移植细胞注入循环系统后，大部分会迁徙到肺脏和肝脏中，真正归巢到心脏的细胞数量仅占很小一部分[46]。目前已有的临床试验证实，只有少于10%的干细胞在移植24 h后能存活。移植4周后，心脏中移植的干细胞仅有约1%能存活[47]。干细胞移植前预处理，提高其在靶器官的存活率显得尤为重要[48]。目前应用到临床试验的主要的方法有：通过基因修饰技术，向移植细胞内转染抗凋亡基因[49]，此方法虽可以提高干细胞移植后的存活率，但基因修饰后的干细胞实际治疗效果有待进一步临床试验证实；将移植细胞与生物材料结合后移植[50-51]，即把移植细胞和先进的生物材料及技术结合以提高移植细胞存活率，但此方法实现条件较繁琐，运用到实际临床试验前还需不断优化；移植前予以缺血、缺氧处理，增强其对缺氧环境下的耐受性[52-53]，即在移植前，预先将移植细胞置于和移植靶区类似的缺氧环境中，激活抗凋亡及抑制促凋亡通路，提高移植细胞的存活率。短时间内，此种方法有效，但移植后远期存活率，有待深入研究。

FANG等[30]研究中证明了在大鼠MI模型中移植hAECs后，有3%hAECs转化为心肌样细胞，且大鼠的心功能得到改善，但是其研究并未阐明心功能改善的具体机制。SONG等[36]在hAECs治疗MI的研究中提出了旁分泌机制，并解释了hAECs移植到梗死心肌后通过分泌各种促血管生成因子，使梗死区侧支循环生成，挽救更多受损濒临死亡的心肌以改善心功能。此研究虽证明了旁分泌机制改善心功能的可行性，但未进一步研究明确哪些细胞因子在MI治疗中起到关键作用。若能明确hAECs分泌的哪些关键细胞因子能修复受损心肌细胞，体外培养hAECs，提取关键细胞因子，再应用到MI患者身上，也不失为一种治疗MI的新途径。其研究还发现hAECs移植后持续分泌细胞因子的时间并不长，间接说明了hAECs在MI治疗中存在的一些劣势。

应对hAECs存在的缺点，ROY等[28]研究中提出在体外使用TGF-β1改良优化hAECs，然后再移植到MI小鼠模型中，并通过实验证明EMT-hAECs可以增强hAECs治疗MI的作用。并阐述hAECs优化后是通过减少受损心肌的凋亡及调节细胞外基质加快修复受损心肌来提高对心功能的保护作用。体外进一步优化hAECs特性，再应用到具体细胞治疗，是细胞替代治疗又一个新的发展方向。外泌体在保护及修复心脏的作用得到越来越多研究证实，但是其具体机制尚不明确，尤其hAECs，其外泌体在MI作用中的研究仍是空白，值得进一步深入探究。

虽然hAECs细胞替代治疗研究还停留在临床前实验研究上，却为MI治疗提供了更多方向和手段，其在MI治疗的研究潜力是不可估量的。相信其后续研究能有更大进展，并真正应用到临床实践中。