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结直肠癌EMT相关LncRNA的研究进展

2019-02-12何祖坤综述松审校

实用癌症杂志 2019年11期
关键词:标志物直肠癌编码

苏 丹 何祖坤综述 白 松审校

结直肠癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,发病率呈逐渐上升趋势,在全球范围内为男性第3位、女性第2位,每年新发约120万例,死亡约60 万例[1],在中国结直肠癌致死居于恶性肿瘤的第5位[2]。结直肠癌确切病因众多且异质性强,目前认为主要是基因突变和基因表达水平综合作用的结果[3-5]。虽然目前针对结直肠癌有多种疗法,包括手术,化疗及针对血管内皮生长因子受体(VEGF)、表皮生长因子受体(EGFR)和程序性细胞凋亡蛋白1(PD-1)/程序性细胞凋亡蛋白配体1(PD-L1)等靶点的靶向治疗,患者通常还是会发生复发和转移[6]。高的肿瘤分期(TNM3和4)、特定的定位(如左结肠)、组织学(肿瘤中基质细胞的含量)和微卫星不稳定性(MSI稳定)是恶化的标志。肿瘤的转移是1个多步骤、多阶段、多途径、涉及多基因变化的一系列复杂过程,其中癌细胞的上皮间质转化(EMT) 是造成转移的重要机制,并且受到一系列基因表达变化的调控。LncRNA的主要功能就是通过调节基因转录相关的复合物活性及其他复杂机理控制下游基因的转录和表达,包括EMT相关基因。 近几年,LncRNA(长链非编码RNA)与结直肠癌关系的研究也逐渐增加,很多证据预示二者之间关系密切。

1 LncRNA的生物学功能

LncRNA是长度超过200个碱基,因缺少开放阅读框不编码蛋白质的RNA,可以位于细胞核内或胞质中。LncRNA参与了广泛的生物途径和细胞过程,具有保护蛋白编码基因、参与X染色体沉默、基因组印记、染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等生物学功能。根据与蛋白编码基因的位置关系,可分为5种类型:正义、反义、双向、内含子间和基因间LncRNA。形成方式有 5 种:①编码蛋白质的基因在多种因素作用下断裂后形成;②染色质重排过程中 2 个分开的区域紧靠到一起后通过转录形成;③非编码基因转录;④小非编码 RNA 中的某段序列多次复制;⑤转录因子中插入一段序列[7]。

Chew等[8]报道很多LncRNAs是蛋白质编码的污染物,其主要通过基因组中的不同区域的RNA pol II转录,起初认为没有实质性作用。但最近研究发现,LncRNA的变化和失调与不同癌症的预后、转移、复发有关。很多研究表明LncRNA在多种人类肿瘤中异常表达,其中在胃癌、乳腺癌、胰腺癌、肝细胞性肝癌、结直肠癌中研究颇多。所以LncRNA有望成为临床上诊疗以上恶性肿瘤的生物标志物和治疗靶点。

HOX转录反义RNA,即Hotair,是长度为2158 nt的LncRNA,包括5个短外显子和1个长外显子,位于染色体12q13,13区域。Hotair的5'端可以与PRC2(多梳抑制复合体2)相互作用,包含EZH2,SUZ12和EED 3个主要亚基,促进调控染色质组蛋白H3赖氨基酸27三甲基化(H3K27me3),以沉默HOXD及其他靶基因转录;Hotair的3'端可与LSD1(称赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶-1)结合,促进组蛋白H3K4去甲基化,以沉默抑癌基因转录表达[9-10]。Hotair基因结构具有高度保守性,但基因序列保真度低。其中,超保守序列与肿瘤中的原癌基因有关,抑制肿瘤细胞的凋亡,当其异常表达时可导致细胞恶变。

Hotair可作为不同类型癌症的预后生物标志物,测量Hotair的表达水平有助于我们预测癌症的阶段并评估生存质量和生存期。

2 影响Hotair表达的主要相关因素

Hotair的表达主要通过两方面的机制来调控,即转录水平的调控和转录后的稳定性调控和传统的通过转录区域上游启动子CPG岛甲基化调控基因转录,Hotair的下游的CPG岛DNA甲基化模式对其表达产生重要影响[11]。

除受到基因组特定区域甲基化影响,Hotair的转录水平也受到转录因子的调控。比如骨桥蛋白(OPN),1个细胞外基质中的磷酸糖蛋白,可以转录激活并增加癌细胞中的Hotair的表达。CD44受体是OPN的正向调控因子,可间接影响Hotair的表达水平;相反,干扰素调控因子1(IRF1)通过绑定到启动子上直接抑制Hotair的表达。实际上,OPN可以控制IRF1,通过影响其信号通路促进Hotair的表达,并抑制IRF的功能[12]。

C-myc与Hotair上游约1053处的E-box元件结合,上调Hotair的表达,通过siRNA敲低C-myc可减少Hotair的表达,降低其启动子的活性,而C-myc上调则可增加Hotair的表达,并增加其启动子的活性[13]。Cai等[14]发现,与Hotair表达水平低的人群相比,Hotair表达水平高的人群结直肠癌发生率更高。Alves等[15]研究了Hotair在 EMT中的作用及其在肿瘤干细胞(CSCs)的发生和维持中的作用,他们揭示Hotair通过触发EMT和获得干细胞特性在致瘤过程中起重要作用。

转录后Hotair的稳定性也受到其他因素的调控,例如 在microRNA-141的介导下,Hotair可被argonante2(Ago2)复合物抑制,进而降低Hotair在肿瘤细胞中的RNA稳定性和丰度。

3 与结直肠癌相关LncRNA

前报道与结直肠癌相关的LncRNA主要包括:H19、Hotair、MALAT1、MEG3、CCAT1、CRNDE、HuLc、KcNQ10T1、LncRNAP21、NPTN-IT1、SNHG16、ATB、LS1NCT5[16]。最新研究发现,SPRY4内含子转录本(SPRY4-IT1)、转化生长因子β活化长链非编码RNA(lncRNA-ATB)、TUG1和LINC01133在结直肠癌中表达上调,SLC25A25-AS1和LncRNA-CTD903表达下调可促进结直肠癌EMT的发生[17]。他们主要影响与结直肠癌相关的信号通路有:Wnt、RAS-MAPK、PI3k、TGF-β、P53。

3.1 H19与结直肠癌的相关性

H19 在细胞中的作用途径很多,研究最为深入的主要是3个,一是Cai等[18]研究发现H19 作为miR-675 的前体,在分解过程中通过释放miR-675来起作用。Tsang等[19]认为H19 通过其产物miR-675来抑制抑癌基因RB的表达,从而在结直肠癌的发生发展中可能起到一种癌基因的作用。有荟萃分析通过H19与结直肠癌患者预后的数据资料发现,H19 高表达组肿瘤分化较低,无病生存率(PFS)和总生存率(OS)均降低[20]。二是Liang等[21]研究报道H19可吸附并消耗miR-138和miR-200a从而发挥ceRNA的作用,促进EMT相关分子Vimentin,ZEB1和ZEB2的表达,从而抑制结直肠癌细胞的侵袭转移;三是Han等[22]发现H19通过招募eIF4A3促进结直肠癌细胞的增殖。通常,周期蛋白包括G1期、S期和M期蛋白3种,CyclinD1可与CDK4特异性结合,形成CyclinD1-CDK4复合体,推进G1期向S期的进程[23]。 H19主要定位在细胞质中,siH19可使细胞周期G1到S期的进展受到阻滞,因此,推测H19通过在细胞质中发挥调控CyclinD1和CDK4的作用,从而影响结直肠癌细胞的增殖[24]。另外,Yoshimizu等[25]研究发现,小鼠结肠息肉数量上升伴随着H19的显著低表达,说明H19可能具有癌基因和抑癌基因的双重作用。 Fellig等[26]通过检测H19在37例结直肠癌并且肝转移的肝转移灶中的表达,发现50%存在高表达,这说明H19可以促进结直肠癌的肝转移。以上研究结果显示H19可能是结直肠癌潜在新癌基因和预后因子,有望成为未来检测结直肠癌的生物标志物。

3.2 Hotair与结直肠癌的相关性

Kogo等[27]报道:Hotair上调与结直肠癌不良预后有关;认为HOTAIR与PRC2协同调控多种基因的表达,并可提高CRC患者未分化癌细胞的水平。Hotair诱导结直肠癌细胞中SUZ12,EZH2和PRC2的表达上调,从而增加H3K27me3修饰水平[28]。结直肠癌的发生发展是环境因素与遗传因素共同作用下的过程。基因的遗传变异,如肿瘤相关的重要转录调控因子、信号通路、效应分子的单核昔酸多态性(SNP),可通过影响基因结构而影响其功能,从而在环境因素的作用下发挥不同的效应,导致结直肠癌的发生。其中tagSNPS影响Hotair的基因组区域,通过改变Hotair的结构参与结直肠癌,其在癌症中的作用仅有Zhang等报道[29]。 rs7958904位于Hotair基因的第6外显子上,CC基因在老年受试者中对结直肠癌有显著的保护作用[30]。rs7958904(影响Hotair)的CC基因型明显降低结直肠癌的风险;rs4759314(影响Hotair)的GG基因型受试者患结直肠癌的发生率明显低于携带AA基因型的受试者。研究结果显示,Hotair的表达水平可作为判断结直肠癌患者预后不良的新指标。

3.3 MALAT1与结直肠癌的相关性

Li等[31]发现,MALAT1 在结直肠癌耐奥沙利铂细胞株中异常表达,对于高表达MALAT1的患者,MALAT1将EZH2与CDH1启动子连接,并在奥沙利铂治疗期间抑制miR-218,最终促进结直肠癌细胞的EMT;但对于低MALAT1表达的患者,MALAT1不能抑制E-钙粘蛋白和表达。ChIP实验进一步验证了MALAT1通过EZH2介导的H3K27me3在结直肠癌中形成来降低E-钙粘蛋白表达。敲除MALAT1 后,结直肠癌细胞的E-cadherin表达增加、Vimentin 表达减少,细胞间连接增加,细胞的迁移和侵袭能力减弱。而奥沙利铂则通过MALAT1 / EZH2途径诱导结直肠癌细胞的化疗耐药。另一研究表明MALAT1通过增加AKAP-9的表达,在体外和体内促进结肠直肠癌(CRC)细胞增殖,侵袭和转移[32]。Xu等[33]在研究结直肠癌转移发生机制时,发现MALAT1 在50%的结肠癌样本中呈高表达,并且MALAT1 的3'末端区域存在突变,进一步研究证明MALAT1 的3'末端区域突变在结直肠癌细胞的增殖、转移和侵袭中起着重要作用。以上研究结果显示MALAT1可能作为奥沙利铂抗结直肠癌的治疗靶点,同时可能成为诊断结直肠癌的新肿瘤标志物,具有临床价值。

3.4 其他LncRNA与结直肠癌的相关性

近期研究发现,CCAT1在结直肠癌组织中表达明显上调,且与肿瘤的侵袭和转移相关,CCAT1较Hotair更有效早期发现结直肠癌。 ncRuPAR在结直肠癌组织中低表达,同时表达水平与肿瘤的转移和预后有关。HOTTIP可以结合并靶向WDR5-MLL复合物至5'HOXA基因座,促进HOXA启动子区域产生H3K4me3修饰从而转录激活[34]。HOTTIP影响结直肠肿瘤的大小和病理分期[35],敲低 HOTTIP可抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移,同时通过靶向SGK1抑制结肠癌细胞凋亡[36]。PRNCR1在结直肠肿瘤组织中的表达水平显著高于癌旁组织[37]。BANCR在结直肠癌组织中低表达,并具有促进肿瘤细胞增殖的作用[38]。UCA1在结直肠癌组织和细胞系中表达明显高于对照组,其作为潜在的分子病因学标志物,通过调节肿瘤细胞的细胞周期和细胞凋亡过程,对肿瘤的早期诊断和治疗具有潜在的重要价值[39]。LncRNA-CCAL可通过靶蛋白AP-2α调节结直肠癌的发展进程,并激活Wnt/β-catenin通路。LncRNA-PCAT1与结直肠癌预后密切相关,可用于预测生存期[40]。

4 EMT

EMT是指上皮细胞转化为具有间质表型细胞的生物学过程[41]。EMT被认为是肿瘤侵袭转移的关键步骤[42]。当肿瘤细胞发生EMT 时,细胞的骨架发生重组,上皮细胞表型缺失,增强细胞间黏附的蛋白如E-钙黏蛋白(E-cadherin)、桥粒蛋白(desmoplakin,DP) 、闭锁小带蛋白-1(zonulaoccludens-1,ZO-1) 、紧密连接蛋白Claudin等表达减少,间质细胞的分子标志物如波形蛋白(Vimentin) 、纤维黏连蛋白(fibronectin,FN) 、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs) 及N-钙黏蛋白(N-cadherin) 等表达增加,从而导致细胞之间黏附能力下降或丧失,细胞间连接松散、失去极性,获得更强的游走、抗凋亡及降解细胞外基质的能力,这是肿瘤发生周围组织侵袭及远处脏器转移的重要生物学过程[43]。

目前,对肿瘤EMT的调控机制仍不明确,根据已有的研究表明,TGF-β、Wnt/β-catenin、Notch、Hedgehog、IL-6/STAT3以及NF-κB等信号通路可诱导EMT进程。EMT中所涉及的重要转录因子有:Snail1、Snail2、Twist1、Twist2、ZEB1和ZEB2等[44-45]。通过检测与EMT相关的经典标志物在恶性肿瘤中的表达,从而明确其在恶性肿瘤预后中的作用,并试图从中选出关键的分子,以筛选具有高转移风险的患者群体,为患者的预后判断、转移预测、个体化治疗等方面提供有效的证据。目前已有的研究显示EMT与乳腺癌、结直肠癌、胃癌等多种癌症的原发浸润和继发转移都有着密切联系[17,46-47],但其具体发生机制还有待进一步的验证。在恶性肿瘤中EMT发生发展的分子机制是当前研究的热点。

5 LncRNA与EMT

ncRNA可通过内源性竞争miRNA,调控与EMT相关的一些转录因子的表达,进而影响EMT进程,最终改变癌细胞的侵袭和转移能力[48]。Dou等[49]建立了Hotair表达沉默的裸鼠肠癌尾静脉注射转移模型,与对照组相比,Hotair敲低后,肠癌细胞肺部转移灶减少。研究表明,Hotair通过参与结直肠癌细胞EMT事件,促进结直肠癌转移的发生。此外,近期研究表明,MALAT1在甲状腺癌、胶质母细胞瘤、结直肠癌等多种恶性肿瘤中均存在表达异常,参与到EMT过程中。

由此可见,LncRNA的表达对EMT起着重要的调控作用。但LncRNA调节EMT的机制十分复杂,且研究尚少,在未来的研究当中,研究者们致力于探寻更多与肿瘤EMT相关的LncRNA,探索其具体发生机制,将为LncRNA诊断治疗肿瘤开辟更宽的路径。

综上所述,LncRNA和EMT在肿瘤发生发展中的关系逐渐受到重视,但其分子机制研究尚处于初级阶段,LncRNA通过信号通路激活相关转录子的表达,影响上皮及间质细胞标志物的表达,调控EMT过程,但仍有大部分LncRNA在肿瘤中与EMT的关联及其分子机制有待进一步研究。LncRNA的深入研究可以为结直肠癌及其他恶性肿瘤的特异性治疗提供线索,有望成为肿瘤诊断及治疗的新靶点。

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