脂肪干细胞的分离培养、分化及其应用

李玉秋，焦玉祥，刘锐，黄飞

（山东华思生物科技有限公司，山东 烟台264003）

脂 肪 干 细 胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是一种间充质干细胞，是从脂肪组织中分离得到的一种具有自我更新和多向分化潜能的干细胞，其含量约占脂肪组织的10%～20%［1］。ADSCs属于成体干细胞，其应用完全可以回避胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESC）在应用时存在的伦理学、法律政策和安全性等多方面因素［1］。而ADSCs同 其 他 间 充 质 干 细 胞（mesenchymal stem cells，MSCs）一样均来源于中胚层的胚胎结缔组织，均是具有多项分化能力的原始幼稚细胞，可分化为多种成体细胞。但ADSCs与其他MSCs相比更具优势性［2-6］：ADSCs来源充足，机体内脂肪分布相对广泛；取材方便，运用吸脂术即可获得脂肪，且创伤较小，患者痛苦较少；ADSCs分离方法相对简单，且产量较高（ADSCs的提取率为1%～2%，而骨髓干细胞的提取率仅有0.001%～0.002%）；ADSCs扩增能力强，增殖迅速，易于传代培养；生物学性状稳定，可塑性强；可跨胚层分化；免疫排斥低等。ADSCs的优势使其在整形医学、临床医学、再生医学等方面均受到了研究者的青睐，本文就ADSCs的分离、鉴定及应用研究进行综述。

1 ADSCs的提取、培养

ADSCs是从脂肪组织中提取的一种MSCs，最早是Zuk等［7］于2001年从吸脂术抽取的脂肪中发现的。随着干细胞研究技术的发展，ADSCs的提取、培养、扩增、冻存技术越来越完善。其中提取分离方法包括了组织块贴壁法、酶消化法、机械分离法（直接离心法、震荡离心法、旋涡离心法、吸附柱法、超声处理法）、胶原酶结合组织块贴壁法、悬浮培养法等［8］。对ADSCs提取后的纯化提取、培养条件、冻存保留等过程需要注意的问题，试剂选择、离心转速、传代代数、冻存试剂、冻存过程等方面，陈犹白等［9］对其进行了详细的分析。

ADSCs的分离提取、培养传代、冻存保留的方法有很多，但让更多研究者认可的方法是：以吸脂术法获取新鲜脂肪，将新鲜脂肪在无菌条件下剪成脂肪粒，剔除血管、结缔组织包膜；用终浓度为0.2%Ⅰ型胶原酶在37℃恒温、恒湿环境中消化1 h；终止消化后，1 800 r/min离心获得含有10%～20%ADSCs的 基 质 血 管 成 分（stromal vascular fraction，SVF），用含10%胎牛血清的LDMEM重悬SVF，用200目筛网将单细胞过滤至培养皿内培养，通过换液传代获得ADSCs，用于后期实验研究［10］。冻存液用DMSO：培养液（含10%胎牛血清）：胎牛血清为1∶4∶5的比例混匀为佳；冻存过程以程序降温法，于-80℃保存为宜。

2 ADSCs的生物学特征

2.1 细胞形态 我们对ADSCs培养发现，接种24 h后，细胞贴壁，呈圆形、短梭形或者多角形，大小不一；待细胞进入增殖期时，ADSCs逐渐伸展呈现长梭形，排列紧密，呈漩涡状生长，细胞形态与成纤维细胞相似，大小均一，多角形及圆形细胞少见［11］。

2.2 特异性标记物 特异性标记物是鉴别不同细胞的理想条件，但ADSCs目前尚没有发现其特异性的细胞表面分子标记物。作为干细胞，ADSCs表达干细胞特异性组合表面标记物CD90、CD105、CD73、CD44和CD166，不表达造血系细胞标记物CD45和CD34。作为MSCs，ADSCs表达所有MSCs标记物如CD10、CD13、CD29、CD44、CD54、CD73，成纤维细胞标记物CD10、CD29、CD91，基 质 细 胞 标 记 物CD13、CD29、CD44、CD49等［12］。2013年，国际脂肪应用技术协会宣布了ADSCs的细胞表型作为其鉴别标准：新分离的ADSCs表型为CD31（-）/CD34（+）/CD45（-）/CD235a（-）；经体外培养的ADSCs表型为CD31（-）/CD44（+）/CD45（-）/CD73（+）/CD90（+）/CD105（+）［13］。

2.3 ADSCs多能性鉴定 ADSCs具有多项分化的潜能，其分化成脂、成骨是其公认的谱系特异性［14］。

2.3.1 ADSCs成脂诱导分化鉴定 将培养成熟的ADSCs用成脂诱导液（HG-DMEM含10%FBS、10-6mol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX、10 μg/ml胰岛素、100μg/ml吲哚美辛）进行诱导，每3 d换1次液。2周后进行油红O染色观察成红色脂滴［3］。

2.3.2 ADSCs成骨诱导分化鉴定 将培养成熟的ADSCs用成骨诱导液（L-DMEM含10%FBS、0.1 mol/Lβ-甘油磷酸钠、10-7mol/L地塞米松和50 mg/L的磷酸化Vc）进行诱导，每3 d换1次液。2周后进行茜素红染色，显微镜下观察可见红色钙结节［3］。

2.3.3 ADSCs成软骨诱导分化鉴定 将培养成熟的ADSCs用成软骨诱导液：高糖DMEM含10%FBS、2 mg/L胰岛素、3 mg/L转铁蛋白、1 mmol/L丙酮酸、100 nmol/L地塞米松和10μg/ml转化生长因子β（TGF-β）进行诱导，每3 d换1次液。3周后进行阿利新蓝染色以及免疫组化检测Ⅱ型胶原蛋白表达［15］。

2.4 ADSCs的分化研究 ADSCs具有较强的分化能力，经过不同的诱导环境，可使其分化为三胚层源细胞。中胚层：除了脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞外，还可诱导成心肌细胞、骨骼肌细胞、血管内皮细胞等；外胚层：神经细胞、表皮细胞等；内胚层：肝细胞样细胞、胰岛细胞、肾样细胞等。

2.4.1 ADSCs向同胚层（中胚层）源细胞分化

2.4.1.1 心肌细胞 Mizuno等［16］认为10μmol/L的5-氮杂胞苷可以将ADSCs诱导成心肌细胞，但由于5-氮杂胞苷存在毒性，还需寻找能够有效替代5-氮杂胞苷的方法。Gwak等［17］发现TGF-β1也能将ADSCs诱导成心肌样细胞。宋克东等［18］研究发现，血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）能诱导人ADSCs于4周后分化为心肌样细胞，心肌肌钙蛋白（cTn-I）、缝隙连接蛋白43（Con43）、肌球蛋白重链（MHC）呈阳性表达，表明AngⅡ可以用来替代传统的诱导剂5-氮胞苷。

2.4.1.2 骨骼肌细胞 Mizuno等［16］用5%马血清和50μmol/L氢化可的松配成的成肌诱导液，诱导ADSCs 6周后，用免疫组织化学法染色鉴定了骨骼肌特异性标记物MyoD 1和MHC的表达，并且发现多核细胞，表明肌管形成。Stern-Straeter等［19］发现，通过改变微环境同样可以将ADSCs诱导成骨骼肌，将ADSCs与含有30%的骨骼肌卫星细胞条件培养基的诱导液能很好地将ADSCs转化为肌细胞，且成肌比例较高。Lee等［20］发现将ADSCs与肌源性干细胞（MDSCs）共同培养也可将其诱导为肌管。

2.4.1.3 血管内皮细胞 Miranville等［21］发现，适当的培养条件可将ADSCs诱导成血管内皮样细胞。付全花等［22］研究发现，含10%FBS、血管内皮 生 长 因 子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）10 ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）2 ng/ml的诱导剂将ADSCs诱导10 d后可呈 现“铺 路 石”样 内 皮 细 胞。Volz等［23］发 现ADSCs成脂诱导14 d后，与血管内皮细胞用1μl/ml R3-胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF），1μl/ml VEGF，0.4μl/ml氢化可的松，1μl/ml A2P和4μl/ml hFGF-β构成的诱导液共同培养14 d，可检测到血管内皮细胞特异性标记物CD31和血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）。

2.4.2 ADSCs向外胚层源细胞分化

2.4.2.1 神经细胞 Ashjian等［7］用在完全培养基中添加5μg/ml胰岛素、0.5 mmol/L二甲基亚甲基黄嘌呤、200μmol/L吲哚美辛配制的诱导液培养ADSCs 14 d，约有20%～25%的细胞分化为具有典型神经形态学特征的细胞。羊书勇等［24］用含有20 ng/ml的bFGF和20 ng/ml的表皮生长因子（EGF）以及2%B27的Neurobasal培养基配制的神经诱导液，培养ADSCs 9 d可测到神经球Nestin阳性，神经球诱导分化5 d后可测到特异性抗原MAP-2阳性。

2.4.2.2 表皮细胞 Brzoska等［25］用终浓度为5μmol/L全反式维甲酸（all-trans-retinoicacid，ATRA）、10%FBS、低糖（1 000 mg/L）DMEM培养基配成的诱导液培养ADSCs 10 d，诱导表皮细胞率为80%。沙德潜等［26］发现用70%的基础培养基、30%的成纤维细胞培养基上清液、10 ng/L重组人EGF组成的诱导液培养20 d，能有效地将ADSCs诱导成表皮细胞，而20 mol/L盐酸法舒地尔（1HA1077）能促进其诱导分化。林文韬等［27］用2%FBS、5μmol/L ATRA、20 ng/ml EGF、10 ng/ml角质细胞生长因子（KGF），0.1μmol/L地塞米松配成的诱导液培养12 d，可见表皮细胞的特异性标记物CK14呈阳性；而在诱导液中加入50%HaCaT上清液，则可增强ADSCs转化成表皮细胞的能力。

2.4.3 ADSCs向内胚层源细胞分化

2.4.3.1 肝细胞样细胞 Talens-Visconti等［28］将ADSCs无血清培养2 d后，用20 ng/ml肝细胞生长因子（HGF）、10 ng/ml bFGF、4.9 mmol/L烟酰胺培养ADSCs 14 d，可将ADSCs诱导成肝细胞样细胞。刘美媛［29］通过用5%FBS、20 ng/ml HGF、20 ng/ml FGF-4配成的低糖诱导培养液，诱导ADSCs 21 d后检测到肝细胞标记物白蛋白的表达，证实ADSCs可以诱导成肝细胞样细胞。

2.4.3.2 胰岛细胞 Liu等［30］用10 mmol/L烟酰胺、1μmol/L exendin-4多肽、2 nmol/L激活素A、10 nmol/L pentastrin、123 pmol/L HGF、1%B27、N2添加剂和17.5 mmol/L葡萄糖配成的无血清DMEM分化培养基培养猪ADSCs 3 d，将诱导液的葡萄糖换成5.5 mmol/L继续诱导15 d，检测到胰岛素促进因子（PDX-1）、胰岛素基因增强子蛋白1（ISL-1）的表达，成功地诱导成了胰岛样细胞。杨光等［31］发现用高糖DMEM（25 mmol/L）、10%FBS、10μg/L bFGF、10 mmol/L烟酰胺直接诱导兔ADSCs 12 d，即可使其向胰岛β样细胞分化。

3 ADSCs的应用研究

3.1 美容整形 ADSCs可以分泌多种生长因子，培养ADSCs的上清液中含有VEGF、bFGF、HGF、胰岛素样生长因子（IGF）、血管生成素（Ang）、TGF、血小板源性生长因子（PDGF）、胎盘生长因子（PIGF）、粒细胞巨噬细胞刺激因子（GM-CSF）等多种因子［32］，因此其在促进创面愈合［33］、美容护肤［34］、毛发再生［35］、心肌梗死后心脏功能改善［36］等方面存在特有的功效。因ADSCs具有多向分化潜能，其可替代、修复衰老的组织细胞，并分泌高效的细胞因子营养组织器官，可以显著提高机体免疫力，增加机体抗病能力，消除疲劳感，恢复体能，维持机体“年轻态”。栾芳等［37］报道用自体ADSCs对面部软组织轮廓整形患者进行治疗，是一种安全有效的整形美容方法。李俊等［38］对ADSCs在乳房整形手术中的应用进行报道。ADCSs在美容整形领域拥有广阔的应用前景。

3.2 临床治疗 ADSCs可以诱导分化成多种细胞，因此在临床疾病治疗中有着广阔的治疗前景。（1）治疗心肌相关疾病：ADSCs可分化成心肌细胞，提高左心室功能和心室壁厚度，改善左心室的射血分数，改善整体心肌功能，可用于治疗心肌梗死、慢性心脏病等［39-41］。（2）骨骼肌损伤修复：ADSCs能分化为成骨骼肌细胞并分泌一些因子，可改善肌肉萎缩状况，促进萎缩骨骼肌再生，修复肌营养不良症，增加损伤骨骼肌的收缩力量及抗疲劳能力［42-44］。（3）治疗骨质疏松：ADSCs可激活成骨细胞和破骨细胞的增殖、分化［45-46］，提高骨密度，降低骨吸收，促进骨形成，有效改善骨组织微结构［47］，可有效促进骨质疏松性骨缺损的修复与再生，从而达到治疗的效果。（4）硬皮病治疗：脂肪移植是治疗硬皮病的一种常用手段，但局限性硬皮病患者移植后的脂肪成活率低。Sreeatrice等［48］发现用ADSCs加以脂肪移植可以缓解硬皮病裸鼠的皮肤；Magalon等［49］临床研究发现，用含有大量ADSCs的血管基质组分（SVF）进行硬皮病的治疗，可以明显改善患者的皮肤病变症状。（5）修复椎体损伤：ADSCs能在特定条件下诱导成骨，Tang等［50］将ADSCs与纳米羟基磷灰石-胶原-聚乳酸联合作为复合支架能有效提高与脊柱的融合率。王腾飞等［51］发现，ADSCs与羟基磷灰石/β-磷酸三钙复合体能够有效修复兔椎体损伤。（6）口腔修复：ADSCs具有多向分化及分泌多种营养因子的功能，其在口腔修复中存在一定的作用。赵佳佳等［52］发现ADSCs分泌的生长因子能够促进口腔内膜成纤维细胞的增殖。Tobita等［53］发现ADSCs和富血小板血浆混合能生成完整的牙周组织。临床研究发现，ADSCs可明显增加患者牙槽骨量缺失严重区域的牙槽骨高度和宽度［54］；ADSCs与β-磷酸三钙支架和重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）能修复下颌骨成釉细胞瘤切除后的骨缺损［55］。ADSCs在难愈性创面治疗［56］、炎性肠病治疗［57］、泌尿系统修复［58］等方面的应用均有相关报道。因ADSCs的多能分化及可分泌多种因子的优势，其在临床治疗中拥有巨大的治疗优势。

4 结语

ADSCs在美容整形、临床治疗、再生医学等方面作用巨大，具有一定的应用价值。但ADSCs的应用也存在一定问题：（1）ADSCs随着细胞传代次数的增加，增殖分化能力将会发生改变，表型也将发生变化，具有向癌细胞分化的潜能。这是ADSCs实际应用亟待解决的问题。（2）ADSCs可以从自身体内的脂肪中获得，很好地解决了伦理道德问题。但不同来源、不同部位的脂肪所提取的ADSCs的分化差异性显著。（3）ADSCs在体外虽然可以诱导分化为多种细胞，但诱导液价格昂贵且含有与肿瘤发生转移有关的生长因子。诱导分化机制目前并不明确。（4）ADSCs诱导分化为其他细胞，分化后细胞的稳定性、特异性的鉴定，诱导液的标准体系还未建立。因此，ADSCs应用的安全性及有效性还需进一步评估，诱导分化机制还需深入研究，诱导体系也需进一步明确，进而发挥ADSCs在多方面的治疗作用。