模式识别受体的免疫调节作为限制流感策略研究进展

宋 丹，孙欣荣

1．西安医学院(西安710068)；2.西安市儿童医院(西安710003)

1 介 绍

流行性感冒是一个严重的公共卫生问题，可致较高的发病率和病死率。鉴于目前的疫苗和抗病毒药物治疗的局限性，预防性治疗旨在增强多方面的先天免疫力。免疫调节策略用来增强对甲型流感病毒(IAV)感染的先天免疫力，以减少肺损伤，或提高疫苗接种的疗效。模式识别受体(PRR)能够识别病原相关分子模式(PAMP)从而区分病原微生物与机体自身[1]，触发这些受体引起的保护性反应以诱导抗病毒宿主防御系统来提供立即的，短期的，以及持久的，特定的免疫。

2 模式识别受体

IAV被至少3个不同类别的PRR细胞识别，包括Toll 样受体(TLR)，RIG-I样受体(RLR)和具有核苷酸结合寡聚域的NOD 样受体(NLR)。TLR是一种膜结合受体，为Ⅰ型跨膜蛋白，胞外区为富含亮氨酸的重复序列，胞内区具有与Toll和白细胞介素1(IL-1)受体家族同源的结构域TIR[2]。TLR配体包括广泛的微生物组分，如脂质和脂肽(TLR2/TLR1，TLR2/TLR6，TLR4)，蛋白质(TLR5)和核酸(TLR3,7,8,9)。除了TLR3之外，大多数TLRs信号通过MyD88依赖的途径来诱导促炎症基因的转录调节，包括I型干扰素，细胞因子，和共刺激分子。TLR3使用TRIF和不同的信号级联激活促炎基因的转录。TLR的表达方式根据细胞类型不同而不同，TLR2、4在巨噬细胞、B细胞、DC中高表达。TLR7、9在浆细胞样DC中高度表达。TLR的激活在抗菌和抗病毒免疫中都是重要的，TLR信号所需的蛋白质突变导致免疫缺陷和广泛的感染易感性增加。RLR是细胞内PRR家族，可识别病毒来源的RNA来启动先天性免疫信号级联。 RLR在上皮细胞、成纤维细胞和一系列造血细胞中是至关重要的病毒感染的传感器。它包括3名成员：RIG-I，MDA-5基因和LGP-2。 RIG-I识别5＇-三磷酸未加帽的ssRNA，这是许多病毒的共同特征，还可以识别短链dsRNA-这可以是病毒复制的副产物。MDA-5结合长链dsRNAs，这由病毒产生，但通常不在宿主细胞中产生。目前，关于LGP-2的知之甚少。RIG-1和MDA5 是细胞浆内的主要抗病毒分子。NLR具有两个亚类: 包括5个成员(NOD1-5)的 NOD家族和包括14个成员的NALP家族。NALP蛋白可通过形成复杂蛋白质复合物-炎症小体, 来活化促炎症胱冬酶[3],来调节先天免疫，炎性小体的功能是上调IL-1β和IL-18的分泌。NLRP3是最有特点的炎症复合体，并在对微生物(包括病毒)的刺激和细胞损伤的反应上有关键作用，其包括NLRP3、接头蛋白ASC、胱冬酶-1。炎性体激活需要两个步骤，第一信号由TLR，IL-1受体和TNFR信号传导介导并激活编码NLRP3 pro-IL-1β和pro-IL-18的基因的转录，导致IL-1β、IL-18和炎性小体的其他组分的合成。共生菌群激活信号1，并因此使宿主细胞对进一步的细胞损伤或感染做出反应。信号2是细胞压力，这是通过改变离子通量、释放线粒体ROS或能量代谢物、溶酶体蛋白酶来感知的，导致NLRP3炎症小体的装配、胱冬酶1的激活和IL-1β 、IL-18的分泌。病毒蛋白和ssRNA以被表明激活炎性小体，因为它们干扰正常细胞功能的能力。

3 细菌的免疫调节作用

3.1 先天性免疫力限制IAV感染 气道微生物群将有可能在气道病原体调节反应中起关键作用。用特定细菌定殖或感染可以限制IAV通过生产微生物产物直接感染。例如，由表皮葡萄球菌产生的一种巨大的细胞外基质结合蛋白被证明阻断IAV的感染。此外，通过细菌产物的粗制混合物刺激先天性免疫，已被证明为限制流感病毒生长及死亡率的免疫调节策略，例如，鼻内给予嗜血杆菌、流感裂解物，霍乱毒素，CpG DNA或修饰的来自大肠杆菌的热不稳定毒素(LTK63)，对小鼠随后的IAV感染有显着的保护作用。

3.2 细菌源性的产物 预防和治疗TLR2和TLR4是TLR 家族中研究最早也是目前研究最清楚的成员之一， 在 LPS 介导的炎症反应中起主要作用[4]。TLR2是革兰阳性菌的主要识别受体，也能识别LPS并介导细胞LPS反应[5]。鼻内施用合成的TLR2激动剂，如Pam2Cys或Pam3CSK4已被报道会引发肺部的炎症反应和先天性反应，保护其免受IAV感染，并减少了其在IAV感染小鼠中的传播。这种保护的具体机制尚不清楚。

TLR4与细菌细胞壁的成分结合，或与天然TLR4配体如LPS、合成的激动剂如脂质A模拟物结合。LPS刺激巨噬细胞后激活的SR-A可抑制TLR4诱导的细胞活化，从而降低炎症因子的释放[6]。另一方面，LPS通过激活的TLR4下游信号转导使巨噬细胞SR-A表达上调[7]。有报道称鼻内用LPS以TLR4依赖性的方式保护小鼠，这是致死流感感染前3d最有效的管理。FimH已被报道激活一系列先天性免疫细胞，包括NK细胞、巨噬细胞和成纤维细胞，通过TLR4/MyD88依赖途径以及重组FimH的阴道递送与对抗小鼠生殖器HSV-2感染的TLR4-依赖的先天性保护有关。FimH介导的对IAV感染的保护反应似乎是部分依赖于肺泡巨噬细胞。TLR4也在病毒感染巨噬细胞后激活PI3K-Akt 途径，并诱导IFN产生，可能增加抗病毒活性。因此，药理学调节TLR4也可能通过作用于PIK3-Akt轴，促进抗病毒活性。合成的脂质A类似物，例如AGPs，解除了脂质A免疫调节作用的毒性。当在IAV感染之前48h施用，几种类型的AGPs在小鼠中提供了对IAV诱导的体重减轻和依赖TLR4方式的疾病的强有力的保护。

此外，用TLR4拮抗剂Eritoran治疗小鼠，减少了IAV诱导的肺病理改变和病毒复制，从而改善生存。有趣的是，Eritoran的疗效也依赖于TLR2，提示相互作用的组合可能增加了在IAV感染期间的保护作用。

TLR9在浆细胞样和其他DC亚群、B细胞、巨噬细胞和单核细胞的内含子区域内表达，并结合细菌或病毒DNA中非甲基化的CpG二核苷酸，触发先天反应。用合成的非甲基化CpG、ODN或脂质体包封的CpG ODN 在致死性IAV感染的前1～5d对小鼠进行鼻内预处理，预防或减少IAV诱导的死亡率。有报告说，用TLR2/6激动剂(Pam2CSK4)或CpG ODN治疗小鼠没有保护其免受致死性IAV感染;然而，当两种治疗同时应用，存活率显着增加。在有轻度，间歇性哮喘的人类受试者，特定CpG ODN的雾化被报道是安全和具有药理活性的，在过敏原入侵期间诱导外周血和痰细胞的IFN-γ和ISGs[8]。但治疗并不抑制变应原诱导的症状，如支气管收缩或嗜酸性粒细胞增多等。

3.3 细菌衍生物：扩大接种策略 细菌毒素衍生的疫苗接种的佐剂主要有：如霍乱毒素B或大肠杆菌热不稳定肠毒素、TLR4激动剂(如MPL)及其衍生物、TLR2激动剂Pam2Cys、TLR5激动剂(如鞭毛蛋白)、TLR9激动剂(如CpG)等。

为了减少细菌毒素来源的佐剂的毒性，突变毒素或低剂量的霍乱毒素B已被有效地使用在鼠模型中[9]；在SE中制定的合成MPL-衍生物GLA被证明增强重组H5亚基疫苗在健康成人中的免疫原性。GLA-SE激活髓系DC产生高水平的Th1-促细胞因子并且当与病毒裂解疫苗结合时，通过抑制IL-10的产生，增强Th1细胞对流感的反应[10]，暗示在现有流感疫苗中添加GLA-SE可能会改善功效。TLR2激动剂Pam2Cys可激活DC上表达的TLR2，诱导高水平的肽特异性CD8+T细胞并促进在继发的IAV感染后的病毒清除及增强抗原依赖性免疫；在流感感染的情况下，TLR5激动剂(如鞭毛蛋白)已被作为佐剂研究，来增强对灭活流感疫苗的反应以及在新型亚单位疫苗的研制。

4 限制IAV感染的先天性免疫的病毒的免疫调节

宿主细胞主要通过细胞模式识别受体识别病毒RNA或DNA来感知和对抗IAV和其他病毒。感受核酸的内体PRR包括TLR3、TLR7/8和TLR9，而RIG-I、线粒体抗病毒信号蛋白、炎性体是细胞质PRR。由病毒或病毒产物触发的这些PRRs，可引起I型IFN的诱导，ISG的调节和促炎细胞因子和趋化因子的分泌;所有这些有助于有效的抗病毒反应。

4.1 病毒来源的产物：预防和治疗 TLR3是识别dsRNA的内体PRR，诱导一系列有效的抗病毒反应。Poly-IC是dsRNA合成的类似物，是最常用的实验性TLR3激动剂。用Poly-IC对小鼠进行预防性治疗保护其免受随后的IAV感染。当通过鼻内途径输送Poly-IC对于限制IAV诱导的疾病是有效的，没有明显的副作用，而全身性输送导致轻度症状。

TLR7(小鼠和人)和TLR8(人类)在系统发生学上相关，内体传感器在浆细胞样DCs和B细胞中表达，这可被病毒ssRNA、咪唑啉化合物、核苷类似物、siRNA刺激。在小鼠中用3M-011(一种合成的人类咪唑啉家族的TLR7/8配体)在IAV感染72h之前或感染6h后鼻内给药与肺病毒滴度急剧下降有关[11]。1V270的肺部给药迅速诱导肺中先天性细胞因子、趋化因子，如肺CD11C+DCs的活化，为小鼠免受致命的IAV的攻击提供保护[12]。

靶向IAV基因中的保守序列的siRNA已被用于抑制体外和体内的病毒生长和IAV感染的动物模型中。改善IAV感染的能力可能是由于其诱导TLR7依赖性IFN-α应答的能力。但是，有效的输送到气道是限制使用基于siRNA的方法来限制IAV诱导的疾病的主要因素，因为“裸”siRNA易在体内降解。目前传送载体包括在带正电的聚合物或脂质或脂质体中包裹带负电的siRNA、或将siRNA与“类脂质”络合。尽管新型递送系统有所发展，但siRNA被有效传递到上皮细胞-肺中IAV复制的主要部位，已被证明是困难的。

细胞溶质RIG-I在启动对抗病毒感染(通过识别携带5＇ppp或5＇pp的病毒RNA来激活I型IFN和促炎反应来对抗病毒感染)的免疫应答过程中起着关键的作用。早期研究表明体外转录5＇ppp ssRNA可能通过RIG-I诱导IFN。然而，近期的研究表明dsRNA的平端与5＇ppp直接相邻，这表明在体外转录ssRNA也可能形成dsRNA产物来激活RIG-1。5＇ppp ssRNA还可以用作预防剂以限制H5N1的复制和体外IAV的大流行。在细胞培养物和小鼠中，给一个IAV特异性siRNA增加一个5＇ppp，可有效抑制IAV感染[13]。

4.2 病毒衍生物：接种策略 用poly-IC和灭活的流感病毒裂解疫苗鼻内给药，诱导针对同源和异源IAV毒株的交叉保护性免疫应答，而没有poly-IC的免疫在小鼠中诱导很小的反应。Poly-IC和相关的dsRNA ONs在小鼠中也被用作佐剂来介导TLR3依赖的DCs的激活，产生特异性CTL 。此外，小鼠用重组IAV核蛋白在poly-IC或dsRNA ONs存在下的接种免疫，其存活率较只接受重组核蛋白高。在减毒流感病毒接种后24h鼻内接种poly-IC，导致呼吸道DC功能增强，引发抗IAVCD8+T细胞，以及中和抗体的产生。有趣的是，Poly-IC只有在疫苗接种24h后接种才能提高疫苗接种的效果。如果疫苗和Poly-IC同时被接种则废除功效。polyIC的佐剂对流感病毒裂解疫苗的效应通过增加TLR2配体酵母聚糖进一步增强。在体外，用poly-IC加酵母聚糖孵化DCs，导致有效的DC活化，并诱导一系列炎症介质，包括TNF-α，IL-6，IL-12，IFN-b和IL-10。

Poly-IC被批准用于人体，其核糖核酸酶稳定形式，poly-ICLC，现在处于癌症治疗的I期和II期试验中。poly-ICLC本身疗效差，但与载体抗原DC相结合，已经在神经胶质瘤的治疗中获得可观的结果。在人类中，poly-ICLC治疗增加了IFN-α的产生、细胞因子和趋化因子的表达，并与激活DCs增强对肿瘤抗原的免疫反应有关。PIKA是poly-IC的稳定衍生物，已被申请作为对抗广泛的Ags的疫苗的新佐剂 。在IAV的鼠标模型中，PIKA鼻内治疗可能参与减少肺中病毒滴度[14]。

5 限制IAV感染的先天性免疫的炎性免疫调节

5.1 炎性体衍生物：预防和治疗应用 在IAV感染的情况下，NLRP3炎性体在 IAV感染后被激活并在IAV感染的小鼠中引发的早期保护性先天应答上发挥重要作用。有研究表明，用NLRP3炎性小体的一种小分子抑制剂-MCC950治疗IAV感染的小鼠 ，如果治疗延迟到高峰(如感染后d3)，会起保护作用[15]。NLRP3炎性体的预防性配体有肠道微生物群、TLR配体(如LPS)。

5.2 炎症反应产物 明矾是第一批被开发的佐剂之一，也是少数人类准许使用的佐剂之一。明矾导致溶酶体中断。与单独接种VLP的疫苗相比，VLP和明矾联合使用可以增加H5N1病毒致死性感染后的老龄小鼠的生存率，暗示明矾可能是增加易感目标群体，如老人的免疫应答的一个有效的策略。

6 展 望

在人类中，PRR刺激配体(如LPS，poly-IC)或促炎细胞因子的应用导致诱导“流感样”症状，限制了它们在治疗疾病中的应用。类似地，siRNA据报导诱导高水平的促炎细胞因子，提出关于他们在治疗病理状态的系统性使用的考虑[16]。poly-IC和Pam2Cys因为他们作为疫苗佐剂的翻译能力获得了更多的关注。详细了解免疫兴奋剂的保护作用的机制及流感感染在不同宿主、不同条件或并发症、不同病毒株中的复杂的炎症反应是需要的。同时，开发调节先天免疫力的疗法必须考虑有效的病毒清除与诱导免疫病理和疾病之间的微妙的平衡。