恒温扩增芯片法在下呼吸道感染细菌耐药基因检测中的应用

2019-02-11林桂阳陈愉生郑雅卿

中国当代医药 2019年36期

林桂阳陈愉生郑雅卿

[摘要]目的探討恒温扩增芯片法在下呼吸道感染细菌耐药基因检测中的应用。方法收集2017年5～10月我院外科重症监护室103例肺部感染患者的下呼吸道分泌物，进行恒温扩增芯片法检测和细菌培养+药敏试验，分析患者的耐药基因检出情况、细菌培养+药敏试验结果、恒温扩增芯片法与药敏试验符合率。结果恒温扩增芯片法在90例患者中检测到13种耐药基因，阳性检出率为87.4%（90/103）。103例患者中49例细菌培养阳性，细菌培养阳性率为47.6%，培养得到50株菌株。对培养的50株菌株进行药敏试验，显示氨曲南和环丙沙星等11种抗生素的出现频率均在20%以上。以细菌培养为金标准，恒温扩增芯片法与药敏试验耐药药物种类相符的样本符合率为65.3%;其中以CTX-M9、OXA-23、MecA、OXA-66、KPC-2和ermB这6个基因符合率最高，且按类别组合分析的结果符合率更佳。结论恒温扩增芯片法的检出率都明显高于传统的细菌培养+药敏试验，且两者符合率较高，在临床上具有良好的应用前景。

[关键词]恒温扩增芯片;下呼吸道感染;细菌耐药;环介导恒温扩增技术

[中图分类号] R56 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2019）12（c）-0032-05

[Abstract] Objective To investigate the application of constant temperature amplification chip method in the detection of bacteria drug resistance genes of lower respiratory tract infection. Methods The lower respiratory tract secretions of 103 patients with pulmonary infection in the surgical intensive care unit of our hospital from May to October 2017 were collected for constant temperature amplification chip detection and bacterial culture+drug sensitivity test. The results of drug resistance gene detection， bacterial culture and drug sensitivity， consistency rate of constant temperature amplification chip method and drug sensitivity test were analyzed. Results A total of 13 kinds of drug resistance genes were detected in 90 patients by constant temperature amplification chip， and the positive rate was 87.4% （90/103）. Among the 103 patients， 49 were positive in bacterial culture， the positive rate was 47.6%， and 50 strains were obtained. The drug sensitivity test of 50 strains showed that the frequency of antibiotics in Aztreonam and Ciprofloxacin etc were more than 20%. Bacterial culture was used as the gold standard， the coincidence rate of samples with constant temperature amplification chip method and drug sensitivity test drug resistance was 65.3%. Among them， CTX-M9， OXA-23， MecA， OXA-66， KPC-2 and ermB have the highest coincidence rate， and the results by category combination analysis have better coincidence rate. Conclusion The detection rate of the constant temperature amplification chip method is significantly higher than the traditional bacterial culture+drug sensitivity test， and the coincidence rate of the two is high， which has a good application prospect in clinical.

[Key words] Constant temperature amplification chip; Lower respiratory tract infection; Bacterial resistance; Loop-mediated isothermal amplification

目前抗生素的耐药性已经成为全球医疗界共同面临的问题，了解致病菌的耐药性是指导临床用藥的重要依据[1]。作为金标准的细菌培养和药敏试验耗时长，可能使患者错过最佳的治疗时机。近年来，耐药基因检测已在科研中推广，但临床鲜有应用，主要原因为可检测的耐药基因比较单一，难以反映复杂的耐药表型。因此，需要一种特异性更好，且能同时对多个耐药基因进行检测的方法。2000年，日本的Notomi等[2]报道了一种恒温的核酸扩增方法，即环介导恒温扩增技术（1oop-mediated isothermal amplification，LAMP），其优点在于特异性强、等温高效、敏感性高，而且操作简便，更加适用于临床。该技术目前已被应用于病毒、细菌、真菌、支原体和寄生虫等方面的检测[3-6]，且已应用于临床医学检测[3]。本研究将LAMP与微流体芯片技术结合，设计成恒温扩增芯片，能同时检测20个耐药基因，基本覆盖了常见感染性疾病尤其是下呼吸道感染常见致病菌的耐药基因。本研究收集了下呼吸道样本进行基因芯片检测，与细菌培养+药敏试验对比，旨在探讨恒温扩增芯片法在下呼吸道感染细菌耐药基因检测中的应用，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

收集2017年5～10月我院外科重症监护室103例肺部感染患者的下呼吸道分泌物，其中男76例，女27例;年龄7～97岁，平均（61±18）岁。纳入标准[7]：①有咳嗽、咳痰的症状和肺部啰音者;②经过胸部CT检查或床边X线检查证实存在肺部感染者;③能使用可控式的负压集痰管经由气管插管或气管切开导管采集下呼吸道分泌物或经支气管镜采集患者的下呼吸道分泌物者。排除标准：①病毒性肺炎、肺部真菌感染者;②肺结核患者。

1.2方法

经由可控式负压集痰管或支气管镜采集下呼吸道分泌物标本，每份标本均做两种处理，一是先提取核酸，后置于恒温扩增芯片装置中进行耐药基因检测，二是直接送细菌室进行细菌培养+药敏试验。

1.2.1恒温扩增芯片法采集的下呼吸道分泌物经过处理后提取核酸（细菌基因组DNA提取试剂盒，玻璃珠法，北京博奥晶典生物技术有限公司，批号：360090），按照操作说明加样到芯片中，使用Rtisochip型低速离心恒温扩增微流控芯片核酸分析仪（北京博奥晶典生物技术有限公司）对已加样的芯片进行检测，软件自动进行数据分析后显示归一化曲线、质控和各检测指标的扩增时间值。检测结果根据样本的扩增时间值与参考值对比，小于参考值为阳性，反之为阴性。

1.2.2细菌培养+药敏实验采集的下呼吸道分泌物标本2 h内接种于血平板和巧克力平板，35℃恒温箱孵育24～48 h，使用VITEK-2全自动细菌鉴定药敏仪（生物梅里埃公司，VITEK-2）或者API鉴定板条对其进行鉴定。药敏试验采用VITEK-2全自动的细菌鉴定药敏仪或K-B法。耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌（Methicillin resistant coagulase-negative staphylococci，MRCNS）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicilin-resistant staphylococcusaureus，MRSA）和超广谱β内酰胺酶（extended spectrum β-lactamases，ESBLs）菌株均用VITEK-2全自动的细菌鉴定药敏仪初筛，确证采用美国国家实验室标准化研究所（CLSI）推荐的确证试验。药敏试验结果则按照培养结果值（药物产生的抑菌圈直径）分成敏感、中介和耐药3个方面。

1.3观察指标及评价标准

分析患者的耐药基因检出情况、细菌培养+药敏试验结果、恒温扩增芯片法与药敏试验符合率。

记录下呼吸道样本的耐药基因检测结果以及细菌培养+药敏试验的检测结果。根据表1中20个耐药基因与耐药种类之间的对应关系，将药敏试验的耐药结果与耐药基因检测结果结合分析，分为3种情况：①符合，耐药基因阳性，且药敏试验的耐药结果提示对该耐药基因所对应的药物耐药;②不符合，耐药基因阳性，但药敏提示该基因对应的药物不耐药;或者反之，药敏提示某些药物耐药，但对应的基因检测却呈阴性;③不完全符合，1份样本测得多个基因，与对应的药敏试验耐药结果符合，部分基因结果不符合。

2结果

2.1恒温扩增芯片法的耐药基因和检出情况

恒温扩增芯片法在90例患者中检测到ermB、aadA1、mecA、CTX13-M1、OXA-66、OXA-23、CTX-M9、kpc-2、mefA、aacC1、CMY-2、DHA-1和VIM-2共13种耐药基因，阳性检出率为87.4%（90/103），检出率前5位的基因为ermB、MecA、aadA1、OXA-66和CTX-M1，分别达到70.9%，32.0%，29.1%，21.4%和19.4%（图1）。

2.2细菌培养+药敏试验的检出情况

在103例患者中49例细菌培养阳性，培养出8种共50株菌株（其中1例检出两个菌株），阳性检出率为47.6%（49/103），检出的菌株分别为鲍曼不动杆菌（14.28%）、铜绿假单胞菌（11.22%）、肺炎克雷伯菌（10.20%）、大肠埃希菌（6.12%）、金黄色葡萄球菌（6.12%）、流感嗜血杆菌（1.20%）、肺炎链球菌（1.20%）和表皮葡萄球菌（1.20%）。进一步对这些检出菌株进行药敏试验，耐药频率最高的抗生素依次为：氨曲南、环丙沙星、阿莫西林/棒酸、头孢吡肟、左氧氟沙星、庆大霉素、亚胺培南、氨苄青霉素、复方新诺明、头孢唑啉和妥布霉素，以上11种药物的出现频率均在20%以上（图2）。

2.3恒温扩增芯片法与细菌培养符合率分析

除去细菌培养阴性，没有药敏试验结果的54例样本无法使用药敏试验作为金标准来分析恒温扩增芯片法的符合率外，共得到49份样本50个菌株的药敏试验结果可与耐药基因检测结果分析对比。对比方法分为以下3种情况。

2.3.1按逐个病例分析即根据表1的对照关系，每份样本作为整体，耐药基因阳性检出率与药敏试验耐药药物种类对比结果是否完全相符，显示符合的有32例，不符合8例，不完全符合9例。恒温扩增芯片法与药敏试验的整体符合率为65.3%（32/49）。

2.3.2按逐个耐药基因分析即单独计算每个检测到阳性的耐药基因与同样本药敏试验的耐药结果符合情况，CTX-M9、OXA-23、MecA、OXA-66、KPC-2、ermB和CTX-M1等耐药基因的检测与金标准具有较高的符合率，分别为83.30%（5/6）、81.80%（9/11）、81.25%（13/16）、80.00%（12/15）、80.00%（4/5）、71.40%（5/7）和64.30%（9/14）（图3）。

2.3.3按基因对应的耐药类别成组分析即按照耐药基因的类别分组后按组分析检测阳性的耐药基因是否与药敏试验耐药结果相符，显示测得同一类耐药基因个数越多，符合率越高。OXA-23、OXA-66、KPC-2組合和CTX-M1、CTX-M9组合的符合率均可达到100%（表2）。

3讨论

恒温扩增芯片法可同步检测20种耐药基因，高效且快速（仅需1 h）。效率和速度明显高于细菌培养+药敏试验。其检测结果与作为金标准的细菌培养+药敏试验结果符合度高，尤其是CTX-M9、OXA-23、MecA、OXA-66、KPC-2和ermB这6个基因按单个或按类别组合分析的符合率更佳，提示这项技术在临床上具有良好的应用前景。

本研究所采集的样本是高质量的下呼吸道分泌物，直接从肺部感染患者的下呼吸道吸取，避开了口腔和上呼吸道菌群的污染。样本细菌培养阳性率为47.6%，与陈文台等[8-9]报道的细菌培养阳性率相近。细菌培养检出的50株致病菌株，前5位为鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌，与文献报道的重症监护室的细菌种类和分布相近[10]。

本研究主要检测到5类不同的耐药基因：①耐甲氧西林葡球菌（MRSA）的耐药基因MecA MRSA是院感的常见病原菌，其耐药性强[11]，MecA是MRSA的标志性基因，测出MecA就能直接明确为MRSA[12]。本研究检测到的MecA基因与药敏试验的符合率为81.25%，在MRSA的感染及流行趋势的检测中具有良好的应用前景。②耐碳青霉烯型（β-内酰胺酶）基因OXA-23、OXA-66及KPC-2曾作为产ESBLs的肠杆菌治疗首选药物的碳青霉烯类抗菌素，其敏感性则在其越来越广泛的使用渐渐丧失。中国CHINET细菌耐药监测[13]报告，2013年碳青霉烯类抗菌素在肠杆菌的耐药率为7%，较2006年的1%显著上升。多重耐药细菌越来越多的得到报道，治疗的难度也日益增加[14]。研究测得的KPC-2、OXA-23和OXA-66是导致细菌耐碳青霉烯类耐药的主要基因，与谢宁等[15-16]的研究结果相符。③ESBLs耐药基因CTX-M1和CTX-M9 CTX-M型ESBLs拥有庞大家族成员，其产酶株的地域分布广泛，菌谱众多，作为主要基因型导致某些地区ESBLs产酶株流行或传播[17]。CTX-M9型在我国最为多见[18]。本研究的样本中检测到上述3类基因的数量增加，相应的耐药性也随之增强，提示二者存在正相关，对临床的抗感染治疗具有重要意义。

本研究检测到另外两类基因为耐大环内酯类和耐氨基糖苷类耐药基因。耐大环内酯类耐药基因ermB的检出率为70.9%，与宋彬容等[19-20]报道的ermB检出率较为一致，因为红霉素为代表的大环内酯类的抗生素耐药性普遍较高，目前的临床应用中有限。耐氨基糖苷类的耐药细菌，具有多种能产生编码乙酞转移酶、磷酸转移酶和腺苷转移酶的基因[21]，本研究的芯片只包含了耐药基因aadA1和aacC1两种，可以解释本类基因的总体符合率偏低（47.4%）。

综上所述，恒温扩增芯片法的检出率都明显高于传统的细菌培养+药敏试验，且二者符合率较高，在临床上具有良好的应用前景。

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