运动诱导生理性心肌肥厚的非编码RNA调节机制

王天慧,肖俊杰

(上海大学生命科学学院,上海200444)

目前,全世界范围内导致人类死亡的各种疾病中,心血管疾病被列为首位[1].随着经济水平和生活方式的不断改善以及人口老龄化的日益加剧,心血管疾病的患病率和死亡率持续上升.据国家心血管病中心统计,我国心血管疾病患者人数已达2.9亿人[2].心血管疾病所引起的社会和经济负担日渐加重,已成为重大的公共卫生问题,防治心血管病刻不容缓.除了药物治疗之外,经常进行体育运动锻炼可以有效地预防和减少心血管疾病的发生[3].据估计,运动可将心血管疾病的发病风险降低50%.运动作为一种心脏康复疗法常用于治疗高血压和慢性心脏病,可以显著降低心力衰竭患者的死亡率和反复住院率[4-5].

非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)是一类不编码蛋白质的RNA分子,它参与细胞增殖、凋亡、分化、代谢等重要生物学过程,其功能失调与疾病的发生和发展密切相关,可以用于疾病的治疗和诊断[6-7].规律运动诱导的生理性心肌肥厚可以保护心脏,生理性心肌肥厚已成为国际上公认的良性适应性反应.非编码RNA是心肌肥厚的关键调节因子之一.近年来的研究发现,运动通过上调或下调心肌某些微小RNA(microRNA,miRNAs),参与调节心肌细胞肥大和增殖、心血管再生,帮助心肌细胞抵抗凋亡,减轻病理性心脏重构和心力衰竭.MiRNAs已成为治疗心血管疾病的潜在靶点[4].对生理性心肌肥厚的关键调控分子的研究能够根据它们在生理性心肌肥厚中的变化,使这些分子的表达升高或降低,往往对心脏重构和心力衰竭具有保护效应.因此,深入探索非编码RNA在运动诱导生理性心肌肥厚的变化规律和作用机制将为研究生理性心肌肥厚的调控机制提供新的视角[8].

下面就几种主要非编码RNA(miRNAs)、长链非编码RNA(long non-codingRNA,lncRNAs)和环状RNA(circularRNA,circRNAs)在心肌肥厚,尤其是生理性心肌肥厚中的调控作用及机制进行综述,并提出基于运动诱导生理性心肌肥厚的关键非编码RNA可以发掘新的治疗心力衰竭的策略.

1 运动与生理性心肌肥厚

规律的运动对心脏具有保护作用.通过规律的运动可以减少腹部肥胖,改善脂质和胆固醇分布,增强葡萄糖代谢,降低血压,改善内皮和心脏功能,同时减少心理压力[9].长期运动会诱导生理性心肌肥厚,能够满足运动所带来的心脏灌注需求的增加.心肌细胞肥大伴随心肌灌注的提高,Ca2+敏感性提高,改善心脏收缩和舒张功能[10].运动可用于治疗高血压和慢性心脏病.运动是心脏康复的一个重要组成部分,可以显著降低死亡率以及反复住院率[4,11].

心肌肥厚是指心肌细胞体积增大,同时伴有心肌细胞内蛋白合成增加,间或伴有间质细胞的增殖.运动引起的生理性心肌肥厚与病理性心肌肥厚表现出不同的分子特征与表型.病理性心肌肥厚是病理性的压力负荷和容积负荷刺激下导致的心肌肥厚,是很多心血管疾病发生的一个主要危险因素,如心力衰竭和心律失常,伴随心肌细胞的凋亡和坏死、心肌纤维化、心功能下降和心室不良重构.长期适当运动作为一种慢性心脏负荷刺激因素,能够诱导心脏发生生理性心肌肥厚.此时,心脏发生非病理性的改变,如左心室容积增加、室壁厚度和心脏质量成比例增加,不伴有心肌纤维化,是长期运动刺激下心脏的一种良性适应性改变,有助于提高心功能,同时对病理性的心肌损伤具有保护效应[12-13].根据刺激条件的不同,心肌肥厚可以分为向心性肥厚(心肌细胞宽度增加)和远心性肥厚(心肌细胞长度增加),或二者兼而有之.由疾病引起的远心性肥厚使心室壁变薄,伴随细胞凋亡、坏死和纤维化,使心室变硬,收缩力受损.持久的耐力训练(如跑步、游泳)可使心脏发生向心性肥厚,而持久的力量训练(如举重、摔跤)会使心室壁厚度增加和心室扩大,诱导心脏发生远心性肥厚[14].

2 非编码RNA的分类与功能

人类基因组中不能编码蛋白质的RNA被称为非编码RNA(ncRNAs),早期研究中由于ncRNAs的生物学功能不明,曾一度被认为是“垃圾序列”[6].然而,近几十年的研究表明,非编码RNA通过多种调控途径维持细胞和组织的稳态,在哺乳动物细胞中的作用和调控功能受到了极大关注[7].根据生物学功能不同,非编码RNA可以分为两大类：管家ncRNAs(house-keeping non-coding RNAs)和调控ncRNAs(regulatory non-coding RNAs),前者通常稳定表达,对细胞存活至关重要,包括核糖体RNA(ribosomal RNA,rRNAs)、转运RNA(transfer RNA,tRNAs)、核内小RNA(small nuclear RNA,snRNAs)和核仁内小RNA(small nucleolar RNA,snoRNAs)等；后者是具有调控作用的非编码RNA,按长度进行划分,较短的包括miRNAs、小干扰RNA(small interfering RNA,siRNAs)、PIWI相互作用RNA(PIWI-interacting RNA,piRNAs)和lncRNAs[7].

非编码RNA在调节心脏生长的病理生理过程中起重要作用.目前研究最广泛的具有调控功能的非编码RNA有miRNAs,lncRNAs和circRNAs.

2.1 MiRNAs

MiRNAs是一类长度为20～22个核苷酸序列的单链非编码RNA分子,起源于核基因组的编码和非编码区域,直接和间接调节细胞质与线粒体中的基因表达[15-16].MiRNA通过与靶基因信使RNA(messenger RNAs,mRNAs)的3’端非翻译区结合,在转录后水平调控靶基因的表达.在绝大多数情况下,miRNAs抑制靶基因的表达,但在少数情况下,miRNAs也可以升高靶基因的蛋白质表达水平.一个miRNAs可以调控多个靶基因,而同一个基因又可以被多个miRNAs所调控,因此miRNAs成为基因表达网络中的重要调控者,参与调控细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学行为.迄今为止,人类组织中已经发现了4 000多个miRNAs[17].

2.2 LncRNAs

LncRNAs是一类高度异质性的单链或双链RNA分子,由大于200个并小于10 000个核苷酸组成.LncRNAs可以通过剪接形成与启动子具有结合能力的多聚腺苷酸尾,参与分化过程中基因的动态表达,多聚腺苷酸尾的存在与否决定了lncRNAs的稳定性[18-19].根据lncRNAs在基因组上的位置,可以将其分为5种类型：①正义lncRNAs,由蛋白质基因编码的正义链转录,与蛋白编码序列享有相同的启动子；②反义lncRNAs,由蛋白质基因编码的反义链转录；③双向lncRNAs,由蛋白质基因编码的两条反向互补链转录生成；④内含子区lncRNAs,来源于次级转录物的内含子区域；⑤基因间lncRNAs,来源于两个基因间隔区的独立单元序列.LncRNAs参与保护染色体完整性、维持基因组结构、X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、表观遗传调节、核内运输等多种重要的调控过程[20].

2.3 CircRNAs

CircRNAs是一类大量存在于真核细胞,不具有5’端帽子和3’端多聚腺苷酸尾、以共价键形成环状闭合结构的单链RNA分子,且不易被核糖核酸酶(ribonucleases,RNases)降解,因而与线性RNA相比具有更高的稳定性.大多数circRNAs是通过前体mRNA的供体外显子3’端与受体外显子5’端反向剪接形成的,少部分由内含子直接环化而成[21-22].CircRNAs在不同物种间具有高度稳定性、特异性和进化保守性,因而具有多种生物学功能.已有研究表明,circRNAs通过与内源性miRNAs竞争来发挥miRNAs海绵的作用,可作为支架来促进、定位和调节蛋白质的功能,调节真核基因表达和线性选择性剪接[23-26].近期的研究表明,circRNAs影响衰老、胰岛素分泌、动脉粥样硬化、癌症和心肌肥厚等[27].

3 非编码RNA与生理性心肌肥厚

3.1 MiRNAs与生理性心肌肥厚

大鼠和小鼠经耐力运动后会引起许多与心脏生长和发育相关的miRNAs分子在心脏中表达的变化.已有研究表明,经过几周的耐力训练,超过200种miRNAs在啮齿类动物心脏中的表达发生改变,其中约60%的miRNAs表达下调[28-29].跑台训练或游泳训练诱导小鼠左心室生理性肥大,miR-1,miR-133a,miR-143,miR-124表达下调[28,30-31].相反地,另一些miRNAs在运动所致的生理性心肌肥厚中的表达是上调的,例如miR-21,miR-144,miR-145,miR-27,miR-223等[29,32-33].但是,对于持续数周的游泳训练后,miR-208b和miR-133b表达上调或下调的报道存在分歧,具体原因尚不清楚[28,34-35].在小鼠运动训练、主动脉弓缩窄术(transverse aortic constriction,TAC)和蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)过表达模型中,miR-1和miR-133在心脏中的表达下调,说明这些miRNAs在生理性和病理性心肌肥厚中同时起作用,而与心肌肥厚属于病理性还是生理性无关[30].而miR-222,miR-34a,miR-210在病理性心肌重构和运动所致的生理性心肌肥厚中具有不同的表达特征,表明这些miRNAs是介导生理性心肌肥厚的关键miRNAs[36].

MiRNAs也在调节与运动诱导的心脏适应性相关的分子途径中发挥作用.在游泳训练后大鼠肥厚的心脏中,miR-29家族表达上调,这与胶原基因表达下调有关,伴随心室顺应性改善,心脏胶原纤维含量下降[37].血管生成增加与运动诱导的心脏生长有关,受血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)途径的调节.在游泳训练的啮齿类动物心脏中,miR-126的表达升高,通过抑制靶基因Sprouty相关EVH1域蛋白1(Sprouty-related EVH1 domain-containing protein 1,Spred1)和磷脂酰肌醇-3激酶调节亚基2(phosphatidy linositol 3-kinase regulatory subunit 2,PI3KR2)(VEGF通路的负调节因子)促进血管生成信号转导[38].PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶,具有调节细胞增殖和凋亡的作用,是运动诱导的生理性心肌肥厚所必需的关键调控分子.心肌特异性敲除PI3K小鼠的心脏体积明显减小,而特异性过表达PI3K小鼠的心脏体积则明显增大.生物芯片分析确定有62个miRNAs受PI3K调节[36].一般来说,当病理性心肌肥厚发生时,心脏的肾素-血管紧张素系统被过度激活,其主要成分血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)和血管紧张素Ⅱ(Angiotensin,AngⅡ)的表达升高.在运动诱导的心脏肥大中,miR-27a和miR-27b(靶基因均为ACE)显著上调,但miR-143(靶基因ACE2)显著下调,这与ACE和AngⅡ的表达水平降低有关,但在接受有氧运动训练的动物中,ACE2的表达水平升高.接受跑台训练的小鼠心脏中的miR-223表达上调,miR-223表达的升高可通过作用于靶基因FBXW7和Acvr2a的3’UTR(untranslated region,非翻译区)诱导生理性心肌肥厚[29,32].MiRNAs分子的靶基因范围很广,其中一些参与了纤维化、凋亡、自噬、血管生成等的调节.介导生理性心肌肥厚的miRNAs下游靶基因有磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)(miR-21,miR 144),结节性硬化复合物2(tuberous sclerosis complex 2,TSC2)(miR145),ACE(miR27a,miR27b,miR143)等,通过作用于靶基因,miRNAs发挥着重要的调节功能[33].

MiRNAs在运动诱导的生理性心肌肥厚中发挥重要的调控功能,能够有效抵抗心肌受损,保护心脏免受不良心室重构过程的影响.已有研究表明,在小鼠游泳和跑步模型中,心脏miR-222的表达均上调,抑制下游靶基因p27,同源结构域相互作用蛋白激酶1(homeodomaininteracting protein kinase 1,HIPK1),HMBOX1(homeobox containing 1),以促进心脏发生生理性肥厚.抑制小鼠体内miR-222的表达会阻碍运动后的心脏生长,减少心肌细胞的增殖.而心肌特异性过表达miR-222可以有效改善小鼠心肌缺血再灌注损伤6周以后的心功能,减少心肌细胞凋亡和心肌纤维化.这说明miR-222是介导生理性心肌肥厚的关键miRNAs,对运动诱导心肌细胞生长和增殖是必需的,并可减轻由心脏缺血再灌注损伤导致的心室病理性重塑和心功能损伤[39].同样,运动小鼠心脏miR-17-3p表达上调,通过抑制下游直接靶基因金属蛋白酶组织抑制剂3(tissue inhibitor of metalloproteinase 3,TIMP3),或抑制PTEN激活Akt信号通路,促进心肌细胞肥大、增殖和存活.在体内抑制miR-17-3p表达会减弱运动诱导的心脏生长,包括心肌细胞肥大和增殖.注射了miR-17-3p激动剂的小鼠在心肌缺血再灌注损伤后不良心室重构减轻.MiR-17-3p有助于运动诱导的心脏生长,并保护心脏免受不良心室重构的影响[40].总之,miR-17-3p和miR-222表达升高,促进了心肌细胞肥大、增殖并抵抗凋亡,增加miR-17-3p和miR-222可以在动物水平改善心肌缺血再灌注损伤所致的心室重构不良和心力衰竭,miR-17-3p和miR-222可能是促进心肌缺血再灌注后功能恢复的新治疗靶点.

3.2 LncRNAs与心肌肥厚

自2013年,首个与心脏相关的lncRNAs Braverheart在心脏发育中的功能被发现以后,越来越多的学者开始研究lncRNAs在心脏病理生理中的作用.在2016年更新的非编码RNA数据库中,lncRNAs已经达到527 336个,人类中有167 150个,小鼠中有130 558个[41].然而,仅有少数的研究分析和鉴定了心肌肥厚过程中lncRNAs的差异性表达.TAC诱导的4周心肌肥厚小鼠模型中,芯片分析鉴定出64个上调的和134个下调的lncRNAs[42].同样,在TAC诱导的大鼠心肌肥厚模型中,80个lncRNAs显著上调,172个lncRNAs显著下调[43].对于人类的研究更多集中在心衰患者的不同阶段,已阐明了lncRNAs在心力衰竭发病机制中的重要作用.非心衰患者心脏、非缺血性和缺血性心衰患者的对比研究揭示心衰患者的lncRNAs和miRNAs的差异化表达,并且lncRNAs可用来区分心衰的病因[44].

LncRNAs可以隔离染色质修饰酶和转录因子等RNA结合蛋白,从而抑制其功能.肌球蛋白重链相关RNA转录物(myosin heavy-chain-associated RNA transcripts,Mhrt),是第一个被报道的与心肌肥厚相关的lncRNAs,大量存在于成年小鼠心脏中.Mhrt通过结合染色质重塑因子1(brahma-related gene 1,brg1)的解旋酶结构域,阻止brg1识别其基因组序列,从而避免病理性心肌肥厚的发生,这表明Mhrt具有保护心脏的作用.实际上,在病理刺激下激活的brg1也会显著抑制心脏中Mhrt的转录,从而引起心肌肥厚和心衰的发生.因此,brg1-Mhrt的反馈调节对维持心脏的内稳态至关重要[45].

通过对小鼠压力负荷性心力衰竭模型的转录组学分析,发现了一种在心脏中高表达的lncRNAs Chaer(cardiac hypertrophy associated epigenetic regulator),被称为心肌肥厚的表观遗传调节器.Chaer在心肌细胞中特异性表达,而Chaer敲除小鼠可明显减轻压力刺激所带来的心肌肥厚,表明Chaer在控制心脏重塑中发挥重要作用.通过66-mer序列的修饰,Chaer影响了多梳抑制复合物2(polycomb repressive complex 2,PRC2)序列的功能,使PRC2不能靶向基因组位点,从而抑制了心肌肥厚相关基因启动子区域组蛋白的甲基化.可见,抑制Chaer的表达,可以减轻压力刺激带来的心肌肥厚和心功能障碍[46].

LncRNAs可作为一种内源性海绵与miRNAs相互作用来控制心脏肥大.小鼠心肌肥厚相关因子CHRF(cardiac hypertrophy-related factor)在压力超负荷后表达升高,导致心力衰竭.CHRF作为miR-489的海绵,下调miR-489,使其下游靶基因myd88上调,通过核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)通路调节诱导心脏肥大的发生[44].在心肌肥厚的小鼠心脏中,lncRNAs Plscr4表达上调,而Plscr4的过表达可明显减轻压力刺激所带来的心肌肥厚.Plscr4通过隔离促肥大的miR-214发挥其抗肥大功能,从而允许Mitofusin 2的表达并减少心肌肥厚的发生[47].

近期的一项研究表明,lncRNAs可能是治疗心肌肥厚相关疾病的新靶点.在小鼠和人类心肌肥厚模型中,lncRNAs Chast(cardiac hypertrophy-associated transcript)的表达会特异性上调,在细胞和动物水平上过表达Chast会导致心肌细胞肥大发生.这是通过促肥大的转录因子活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)激活Chast,自噬调节因子Plekhm1表达上调,阻断心肌细胞的自噬来实现的.该研究通过lncRNAs沉默方法——反义寡核苷酸来抑制小鼠心肌肥厚模型中Chast的表达,通过静脉注射的方式达到目的分子沉默的效果,揭示了lncRNAs在心脏疾病治疗中的临床应用潜力[43].

但是,目前运动诱导的生理性心肌肥厚的关键lncRNAs尚不清楚,有待进一步研究.

3.3 CircRNAs与心肌肥厚

虽然已证实心脏中含有大量的circRNAs,但其功能和机制还不十分明确.据报道,一些circRNAs可以作为内源性海绵与miRNAs相互作用并影响其靶基因的表达.CircRNAs ciRS-7/CDR1as,Sry,HIPK 3以及与心脏相关的HRCR(heart-related circRNA)作为miRNAs海绵,可以降低miRNAs的活性.HRCR作为miR-233的内源性海绵,miR-233通过作用于靶基因细胞骨架活性调节蛋白(activity-regulated cytoskeleton-associated protein,ARC)来调节心肌肥厚,HRCR通过与miR-233竞争性结合并提高小鼠ARC的表达来抑制肥大反应[48].

与miRNAs相比,circRNAs在调节心肌肥厚功能中的研究较少,多数研究集中在与心脏病相关的circRNAs的识别与鉴定[49-50].基因表达谱分析已鉴定成年小鼠心脏中有575种circRNAs,很多circRNAs候选基因都是从心血管疾病相关基因座中转录出来的.通过比较大鼠新生心肌细胞和成年心肌细胞、假手术和TAC手术小鼠心脏、心衰和非心衰的人类心脏,生成了不同种类心脏中circRNAs的基因表达谱,结果表明circRNAs在患病的人类和啮齿类动物心脏中大量表达,但仅有少数的差异性表达.在从胚胎到成体的发育过渡期,大鼠心脏中的circRNAs表达有显著差异,但调节心肌重量的circRNAs功能尚不明确[51-52].此外,运动诱导的生理性心肌肥厚的关键circRNAs也不明确,有待进一步研究.

4 结语与展望

近年来的研究已经表明,非编码RNA通过调节基因表达在生理和病理性心肌肥厚中发挥重要作用.在小鼠、大鼠和人类的心肌肥厚过程中,大量的miRNAs,lncRNAs和circRNAs失调.与心肌肥厚相关的生理和病理应激都可以调节miRNAs的表达,通过直接诱导mRNAs降解或抑制靶基因的翻译来调控多种心脏肥大相关的信号通路.LncRNAs通过充当内源性miRNAs海绵、隔离染色质重塑因子或通过顺式调控机制调节邻近基因的表达来调控肥厚相关基因.在病理性心肌肥厚的心脏组织中已经发现了circRNAs的表达谱,但是circRNAs在心肌肥厚中的作用和机制尚未阐明.多个miRNAs,lncRNAs和circRNAs HRCR已被证明是心脏肥大和心力衰竭的潜在治疗靶点.

在非编码RNA中,只有miRNAs对运动诱导的生理性心肌肥厚和细胞增殖调节的相关研究比较充分,而lncRNAs和circRNAs在运动诱导的生理适应调节中的作用机制则知之甚少.已知大量的miRNAs在耐力训练后的心脏中有不同的表达,运动可通过调节miRNAs减轻糖尿病、心肌梗死等疾病诱导的心肌细胞凋亡、心肌纤维化等,产生生理性心肌肥厚等心肌保护效应,抑制病理性心脏重塑,改善心肌功能.一些miRNAs如miR-222和miR-17-3p是运动诱导的心肌肥厚所必需的,对心脏具有保护作用,可能是促进心肌缺血再灌注后功能恢复的治疗靶点.因此,有关运动诱导的生理性心肌肥厚的非编码RNA分子机制及其调控网络值得进一步深入研究,有助于阐明运动促进心脏健康的发生机制,为未来治疗心血管疾病提供新靶点和新途径.