成体哺乳动物心肌细胞增殖及其调控

刘秀秀,周 斌

(中国科学院中国科学院生物化学与细胞生物学研究所中国科学院分子细胞科学卓越创新中心细胞生物学国家重点实验室,上海200031)

心脏作为哺乳动物的肌肉泵,通过收缩向全身供血,在哺乳动物的一生中发挥着极其重要的作用.心血管疾病是目前造成死亡人数较多的几种疾病之一,尽管现代医学已经对这类疾病的治疗有了很大的进步,但是更深层次的治疗策略需要依靠对生理基础更进一步的认识,其中心肌细胞的增殖一直是研究领域内的热门话题.

1 成体心脏心肌细胞增殖

最初,普遍认为成体心脏中心肌作为一种终末分化彻底的细胞类型,基本不发生增殖[1-3],除非在发生损伤比如心肌梗死(myocardial infarction,MI)的情况下才会有增殖现象[3].由于心肌细胞普遍存在多核以及多倍体现象[2],单纯的增殖分子标记的染色很难推测出潜在的待分裂细胞.所以如何检测细胞的增殖一直是困扰领域内研究者的一大难题,直到2009年Bergmann等[4]巧妙地利用了同位素标记(14C)这一经典的生物学研究方法.该研究使用的方法学基础是利用冷战时核弹爆炸释放到大气中的14C,这些碳元素很快遍布全球并随着掺入动植物而掺入人体,因此人体在某个时间段内产生的细胞的14C含量与当时大气中的14C含量是一致的.由于碳元素有着漫长的半衰期,人体内细胞自产生到死亡,14C的含量是不变的,因此通过比对不同年份大气的14C含量与不同细胞的14C含量就可以推测出该细胞的出生日期.已有研究得出人一生中约有50%的心肌细胞被替换为新的心肌细胞,而且越年轻的心肌细胞的更新速率越快——25岁时一年约更新1%,到了75岁一年约更新0.45%[4].后续的研究发现,人体内间质细胞和内皮细胞都以较高的年更新速率进行更新换代,只有心肌细胞基本处于低增殖的水平.但是3种细胞的更新换代水平都随着年龄的增长而降低[5].另有独立的研究认为,人心肌细胞在心肌梗死损伤后会出现增殖[6],而心肌细胞的平均寿命约8年,每年有13%左右的新心肌细胞生成[7].这些领域内的开辟性发现为后续的研究提供了方法学以及最终结果的指导.2012年,Steinhauser等[8]发展出利用稳定的同位素对细胞进行成像的多同位素成像质谱(multi-isotope imaging mass spectrometry,MIMS)技术,该技术可以在亚微米的分辨率下检测稳定同位素的掺入,这为后续利用同位素掺入心肌细胞进行增殖研究提供了技术支持.利用15N的掺入,细胞内较自然水平的15N∶14N(0.37%)比值若有升高,则说明细胞发生了DNA的复制.以此为基础计算出成体小鼠一年大概有4.4%的心肌细胞发生了DNA的复制[9].成体心脏中心肌细胞的多核以及多倍体现象使同位素掺入得到的结果可能仅仅是DNA复制而不是细胞周期的完成,但是检测发现15N+的心肌细胞相较15N-的心肌细胞具有更高比例的二倍体心肌细胞,说明15N+的心肌细胞虽然不是全部但是部分完成了完整的细胞周期.大量的统计结果显示15N+的心肌细胞中有约17%为二倍体,若发生DNA复制后还维持了二倍体的核型则认为母细胞发生了完全的细胞分裂,产生了一个新的心肌细胞,那么成体小鼠中一年大约有0.76%(4.4%×17%)的新的心肌细胞产生.

Bergmann等[4-5]和Senyo等[9]利用同位素掺入,以研究DNA复制的方法研究人与小鼠这两种代表性哺乳动物成体后心肌细胞的增殖情况,为心肌细胞增殖领域的研究奠定了坚实的基础.但是心肌细胞的多核和多倍体现象使得检测到的信号存在一定的欺骗性,仍然有更进一步的工作需要完成.

除了同位素掺入的研究方法,过去的十几年也见证了其他研究心肌细胞增殖方法的发展.早在2005年,Liqun Luo实验室[10]就发展出了一种利用染色体间的同源重组来标记细胞的策略——mosaic analysis with double markers(MADM).在MADM小鼠的两条染色体上,每条染色体包含一个被loxp位点隔断的绿色荧光蛋白(green f l uorescent protein,GFP)的部分编码区和红色荧光蛋白(red f l uorescent protein,RFP)的部分编码区,另一条染色体上则包含被loxp隔断的两种荧光蛋白的剩余编码区,编码区均按照N端到C端的顺序排列.这一基于Cre同源重组酶识别loxp位点进行同源重组的遗传工具小鼠,在细胞周期的G2期细胞内存在同源重组酶Cre的情况下,由于细胞内的两条染色单体在一定概率下会发生染色体间的同源重组,使得同种荧光蛋白的编码序列重组到一条染色体上.在后续M期的染色体分配中,有一定概率重组后的仅包含单个荧光蛋白编码基因的染色体被分配到两个细胞中,这样分裂过后的两个子代细胞分别被标记了绿色或者红色荧光蛋白.也有一定概率仅包含单个荧光蛋白编码基因的染色体被分到了同一个细胞中,那么细胞就同时表达绿色和红色荧光蛋白.值得注意的是,如果细胞周期没有完成而仅发生了DNA复制甚至细胞未发生DNA复制,则细胞都有一定概率发生同源重组,细胞也会同时表达绿色和红色荧光蛋白,这在细胞分裂研究中是一个干扰的结果.因此Ali等[11]利用这一系统研究心肌细胞增殖时,仅研究细胞中带有单色荧光的实验结果,发现新生的小鼠确实会出现单色的心肌细胞,但是大部分的心肌细胞是双色标记的,并且单色标记的心肌细胞并不会出现数目较多的细胞克隆.这都表明即使在新生期,心肌细胞也仅仅具有有限的增殖能力.在成体心脏中,正常生理条件以及左前降支结扎的条件下,4周之内心肌细胞基本不会出现单色标记.但这并不能说明成体心肌细胞不再增殖,因为MADM系统存在较低的重组效率,可能会损失确实发生了心肌细胞增殖产生的单色重组信号.2018年,同一实验室的Sereti等[12]利用Rainbow报告基因系统进行克隆分析,在胚胎9.5、胚胎12.5、出生后当天进行标记,在后续的不同时间点收样显示心肌细胞所形成的每个克隆随标记时间的后移,所包含的细胞数目变少,说明从胚胎期开始随着小鼠慢慢长大,心肌细胞的增殖能力在逐渐减弱.这些小鼠早期的实验结果均提示在成体期小鼠心肌细胞增殖的极低概率,与之前同位素掺入得到的结论并不矛盾.

Reza实验室上述实验结果的取得,得益于复杂的报告基因系统.是否可以利用增殖的标志蛋白驱动重组酶表达来标记细胞进行谱系示踪？Hans Clevers实验室对此问题进行了尝试[13-15].该实验室挑选了在细胞周期G1,S,G2,M期均存在表达的Ki67分子作为后续追踪增殖信号的分子标记,并在小肠这一增殖比较旺盛的组织中检测发现,Ki67直接驱动报告基因(RFP)表达可以检测到增殖信号.为了进行进一步的谱系示踪,Ki67IRES-CreERT2基因敲入小鼠应运而生,Basak等[14]首先在神经干细胞领域研究了活跃神经干细胞在稳态和损伤情况下的增殖.近期研究表明,成体心脏中几乎不具备可以转变成心肌细胞的心脏干细胞[9,16-17],成体心脏中的心肌细胞基本由已经存在的心肌细胞增殖而来[9].那么上述两个遗传工具便可以深入研究该领域的遗留问题,首先结合Ki67tgRFP与单细胞测序发现损伤情况下新生的小鼠心脏会出现增殖的心肌细胞,而成体的小鼠心脏在损伤情况下并不会出现增殖的心肌细胞信号[15].进一步利用Ki67IRES-CreERT2基因敲入小鼠进行谱系示踪发现,随着时间的推移,小鼠的心肌细胞增殖能力越来越弱,与Reza实验室[12]的研究结果一致.在心肌梗死损伤后,谱系示踪结果显示非心肌细胞响应MI的损伤进行了增殖,但是在损伤区基本没有发现被标记的心肌细胞,损伤边缘区、远离损伤区与未进行损伤的对照组被标记的心肌细胞数目基本无差异——4周之内发生过Ki67表达的心肌细胞占总心肌细胞的0.1%左右[15].这说明生理状态下心肌细胞以极缓慢的速度进行增殖,并且这种增殖并不会因为被心肌梗死损伤刺激而变快.

值得注意的是,Ki67的表达贯穿整个细胞分裂周期,如果心肌细胞仅发生DNA复制或者发生后续的核分裂而不发生胞浆分裂,那么该细胞也会表达Ki67.因此,被荧光蛋白标记的信号要大于真正发生细胞分裂的信号,说明成体心脏中心肌细胞的增殖比例要比检测到的更低.另一方面,目前使用的谱系示踪存在技术上的局限,单次或者几次他莫昔芬(tamoxifen)的注射很难捕捉到Ki67启动子还未活跃但是在追踪的时间历程中Ki67启动子活跃起来的细胞活动,在这一程度上,上述谱系示踪技术又遗漏了真实的细胞增殖的信号.在心肌细胞增殖领域捕捉真实的心肌细胞分裂仍然是一个值得进一步研究的科研问题.

上述研究普遍认为随着小鼠年龄的增长,心肌细胞的增殖能力逐步降低.但是2014年,一项关于在青春期前小鼠心肌细胞增殖的研究引起了争议[18].该研究认为在小鼠青春期前的14天晚上到15天早上心肌细胞增殖显著升高,并且这种增殖集中在左心室的心内膜一侧.随后另外两篇报道提出异议[19-20],认为在青春期前的这段时间心肌细胞的增殖基本是随着时间的推移而下降的,不存在一天内心肌细胞增殖速率显著升高又显著下降的现象.

2 成体心脏心肌细胞增殖的分子基础

2.1 细胞周期相关基因

早在2004年,就有研究指出细胞周期蛋白Cyclin A2过表达会引起出生后的心肌细胞增殖升高[21].进一步的探究表明,Cyclin A2过表达的转基因小鼠在心肌梗死后相较于对照组野生型小鼠具有增强的心脏功能和较少的心肌损伤[22].Cyclin A2过表达促进心肌增殖、降低心脏损伤的作用同样适用于心肌梗死后的猪模型[23].利用腺病毒载体在损伤区原位注射过表达Cyclin A2的腺病毒可起到增强心脏功能、促进心肌细胞增殖的作用.利用MADM分析系统[10],Mohamed等[24]发现组合型的细胞周期蛋白CDK1/CCNB/CDK4/CCND在体外和体内均能引起心肌细胞的增殖,这种刺激心肌细胞增殖的组合可以被简化为抑制Wee1与TGFβ信号通路同时组合周期蛋白CDK4/CCND.抑制细胞周期的p21的抑制基因——REST对于心脏再生中的心肌细胞增殖具有重要的促进作用[25].

2.2 转录因子

Yap是Hippo信号通路的“明星”分子,在各种生物学功能中具有重要作用[26-27].Yap作为转录因子可以启动下游许多基因的表达.通过敲除Hippo上游基因Salv可起到过表达Yap的效果,基因敲除(Yap过表达)后小鼠心脏变大,而这种变大主要是由心肌细胞增殖升高引起的[28].另一方面,Yap敲除的小鼠表现出心脏变小,MI之后恢复变差的表型[29-30].在成体心脏中过表达持续激活的Yap会导致心脏心肌细胞持续增殖,心肌细胞数目变多,心室壁变厚[31].心肌细胞的这种变化是因为Yap被激活的染色体打开了部分分子位置.其他转录因子如Tbx20[32],BRG1[33],ERBB2[34],ERBB4[35]均具有促进心肌细胞增殖的作用.而Meis1[36]在心肌细胞中被敲除后对心肌细胞的增殖具有促进作用.

2.3 微小RNA

微小RNA(microRNAs,miRNAs)作为一类长度为20～25个核苷酸的单链非编码RNA,在体内通过同源重组结合到信使RNA(messenger RNAs,mRNAs)的3’端非编码区上进行基因的转录后调控[37-38].通过高通量的筛选结合进一步的体外实验得出微小RNA hasmiR-590-3p与has-miR-199a-3p能够引起出生后的心肌细胞增殖,而不引起心脏成纤维细胞的增殖,通过腺病毒载体过表达这两种miRNA,成体心肌细胞的增殖也会升高,并且有助于提高MI后的心脏功能[39-40].MiR99/100信号通路在心脏再生中从斑马鱼到小鼠是保守的,但是在损伤后无法自激活.外源表达该信号通路的基因使得成体心肌细胞在体外可以增殖[41].关于miRNA促进心肌细胞增殖的研究从小动物逐渐走向大动物并且一步步在向人体接近.利用人源多能干细胞分化来的心肌细胞(human induced pluripotent stem cellsderived cardiomyocytes,hiPSC-CM)体外培养筛选出对人源心肌细胞体外增殖有促进作用的miRNAs,发现这些miRNA大部分都作用于Hippo信号通路.抑制单个miRNA不足以影响心肌细胞的增殖,但是Yap在心肌增殖中有着不可或缺的作用[42].最近发表的一项研究将之前筛选出的miRNA——has-miR-199a利用腺病毒过表达到心肌梗死手术后的猪的心脏损伤区,发现过表达之后猪心脏损伤区变小,心脏功能增强,心肌细胞增殖升高[43].这为临床治疗心脏疾病提供了新思路,但是值得注意的是,在后期由于miRNA的表达不受控制,75%的实验猪死于突发性的心律不齐.

调控心肌细胞增殖的分子基础千千万万,各有各的重要性.深入研究调控心肌细胞增殖的分子网络,有助于调控心脏再生,为心脏疾病的临床治疗提供借鉴.

3 成体心脏心肌细胞增殖与所在“环境”

3.1 低氧环境

在许多组织器官中,干细胞或者祖细胞多存在于由缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1 alpha,Hif-1α)所维持的低氧环境中[44-45].Kimura等[46]利用Hif-1α的氧依赖降解(oxygen-dependent degradation,ODD)域在正常氧含量下引导Hif-1α降解,而低氧含量下维持Hif-1α的蛋白稳定的特性将ODD域融合到CreERT2的C端,那么正常氧含量下表达出的CreERT2被降解,低氧含量下的CreERT2被稳定.当他莫昔芬(tamoxifen)诱导时,低氧环境中的CreERT2入核识别loxp位点标记目的细胞.被标记的心肌细胞展现出增殖心肌细胞的特性,而且在整个心脏上分布于靠近心内膜以及心内膜心外膜之间的区域,在心外膜一侧分布较少[46].

心脏内部的低氧环境孕育出一批具有增殖特性的心肌细胞,外部环境的低氧是否也能诱导出增殖心肌细胞？答案是可以的.将成体小鼠的饲养环境氧含量在2周内缓慢降低到7%并维持两周,发现心肌细胞的DNA损伤减少,心肌细胞数目增多,心脏变大,并且损伤后恢复更好[47-48].

低氧是许多再生器官的一个共同特征,虽然生物体不能忍受长时间的低氧,但是短时间的低氧能够引起部分心肌细胞重新进入细胞周期进行增殖,这给心脏再生研究领域提供了新的思路.

3.2 孕期

已有研究发现怀孕后的母鼠心肌细胞增殖变快[49],而这种增殖变快是通过血液中含量上升的调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)引起的,杀死血液中的Treg后心肌细胞增殖变缓.Treg细胞作为一种抗炎细胞因子[50],在孕期母体血液中上调Treg水平可促进对胎儿的免疫耐受[51].

免疫系统遍布全身且有许多值得挖掘的问题,免疫系统的加入使心肌细胞增殖领域的研究更加全面.

3.3 运动

运动作为一种健康的生活方式被认为可以有效防治多种心血管疾病[52],并且可以通过多种细胞和分子机制促进心脏再生[53].Vujic等[54]利用2012年Steinhauser等[8]使用的检测增殖技术检测到当小鼠每天在转轮上运动5.6 km左右,并持续运动8周,心肌细胞的增殖速率变快.8周内利用同位素掺入检测到15N+心肌细胞的概率由正常活动小鼠的1.24%上调到运动小鼠的3.62%,并且运动小鼠的15N+心肌细胞的单核二倍体心肌细胞数目增多[54].在此之前也有研究表明,游泳可以促进心肌细胞数目的增多[55].运动促进心肌细胞的增殖研究目前基本停留在现象发现阶段,仍需要结合分子调控网络进行进一步的研究.

3.4 周边细胞衰老的微环境

细胞衰老在生理以及病理条件下均起重要作用[56],进一步研究发现瞬时的细胞衰老促进发育与再生[57-58].最近“背靠背”的两项研究认为,新生期心脏损伤过程中出现的衰老的成纤维细胞促进了心脏修复过程中心肌细胞的增殖[59-60].这两项研究也为后续成体期心脏损伤修复中心肌细胞增殖的研究开辟了新思路.

4 从心肌细胞自身出发探究细胞增殖

细胞内含有两套同源染色体被称为二倍体,当细胞内染色体多于这个数量时,无论是分布在一个核内还是分布在几个核内都被称为多倍体[61].多倍体在不同组织器官中对于增殖的作用不同,多倍体的肝脏细胞就贡献到肝脏的增殖中[62].那么,在心脏心肌细胞中多倍体起什么作用呢？

经常与不同物种心脏的高再生与低再生能力联系在一起的就是心肌细胞不同的DNA含量[35,63-64],更具体一些,低再生能力的心脏含有大部分的多倍体心肌细胞[65].斑马鱼作为拥有高再生能力心脏的物种,心肌细胞绝大多数为二倍体.Gonzalez-Rosa等[66]利用遗传学方法将斑马鱼心脏中部分心肌细胞变为多倍体,通过镶嵌分析发现心肌的多倍体化阻碍了心肌细胞的增殖与心脏再生.进一步对多个物种进行研究,发现是甲状腺激素上调调节体温代谢的同时诱导了心肌细胞的多倍体化,使得哺乳动物的心肌细胞增殖能力降低[67].

哺乳动物心肌细胞的多倍体化是一个在成体前就完成的历程[20],基本无法在成体心肌细胞中将细胞去多倍体化,因此进一步研究心肌细胞多倍体以及抑制其增殖的机制才有可能将这一发现向临床治疗上推进.

有学者认为心肌细胞的肌节结构阻碍了细胞分裂[68],也有学者认为心肌细胞的代谢状态可能利用氧化磷酸化抑制心肌细胞的增殖[48].

5 结束语

哺乳动物成体心脏中已被证实基本无干细胞可以转分化为心肌细胞[17],因此心脏受损伤之后的修复基本靠心肌细胞自我增殖完成.已有研究已证明哺乳动物心肌细胞以一定缓慢的比例更新换代[4-5,9],但不同的方法或不同实验室得出的结论存在差异,研究出领域内具有金标准的心肌细胞更新速率仍然是值得进一步研究的课题.虽有大量研究探索影响心肌细胞增殖的具体机制,但如何调控心肌细胞增殖仍然是一个值得深入研究的领域.完全成熟的心肌细胞与较强的增殖能力之间有着难以逾越的鸿沟,通过关注靶向多个靶点与信号通路的分子可能实现心脏心肌细胞增殖与心脏再生.