非编码RNA在调控心脏细胞死亡相关的心血管疾病中的作用

董妍涵,王 昆

(青岛大学转化医学研究院,山东青岛266021)

心血管疾病是导致全球发病率和死亡率上升的严重问题.心肌细胞的损失与多种细胞死亡和存活过程相关,包括细胞凋亡、自噬和坏死,同时牵涉不同的调节通路[1].在过去的几十年中,人类不断探索心肌细胞死亡的调节机制以改善心脏衰竭.线粒体是心肌细胞中活性氧物质和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的主要生成来源[2],其形态变化与细胞死亡过程紧密相关.

在通常情况下,非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)是一类来自非编码区的RNA.根据长度分为两大类：长链非编码RNA(长度超过200 nt的lncRNA,long ncRNAs)；短链非编码RNA(＜200 nt),包括miRNA(microRNAs),siRNA(short interfering RNAs),piRNA(piwi-interacting RNAs)等[3],其中miRNA是一类小的(22～24 nt)高度保守的非编码RNA,通过碱基互补配对结合mRNA的3’或5’非翻译区(untranslated region,UTRs),从而抑制蛋白翻译或促进mRNA降解来介导转录后基因沉默[3-5].早期,Berezikov等[6]和Graves等[7]详细介绍了miRNA的产生过程.越来越多的证据表明,许多miRNA通过调节心肌细胞死亡的信号通路来参与心脏疾病的发展进程.

1 非编码RNA与细胞凋亡相关的心脏疾病

细胞的死亡模式主要有3种：凋亡、自噬和坏死[8-9],其中细胞凋亡也称为程序性细胞死亡,是一种物种间高度保守的生物调节过程[9],它的激活主要通过两种不同的信号途径,即外源性死亡受体途径和内源性线粒体途径.细胞凋亡信号通路被激活后,通常伴随着结构变化,包括细胞皱缩、核浓缩和DNA断裂,最终导致细胞完全破坏[10].

已有研究表明,细胞凋亡与基因的表达紊乱相关,会导致心脏病变[11].近年来,在心肌病的发病机制中,已经发现大量的miRNAs参与细胞凋亡信号通路的调控.例如,miR-133可通过负调节caspase-9来抵抗H2O2引发的细胞凋亡[12],过表达miR-133a可抑制心肌纤维化[13].此外,miR-1在人的梗死心脏中下调[14],敲低miR-1可以抑制心律失常[15],细胞水平过表达miR-1可以通过靶向抗凋亡蛋白Bcl-2来促进氧化应激下的细胞凋亡[16].近期研究发现,miR-181c参与肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导的细胞凋亡,并通过靶向Bcl-2导致心力衰竭[17].此外,miR-21,miR-320,miR-199a和miR-30通过靶向不同的凋亡相关蛋白促进心脏细胞凋亡程序[18-21].活性氧(reactive oxygen species,ROS)可以氧化修饰miR-184,从而识别Bcl-xL和Bcl-w[22].在心梗模型小鼠中的进一步实验证明,氧化的miR-184与Bcl-xL和Bcl-w的配对加重了ROS诱导的心肌组织损伤.

众所周知,线粒体不断地通过分裂和融合来应对不同的环境变化.已有研究表明,线粒体的分裂/融合能够分别促进或抑制心肌细胞的凋亡[23-24].在心脏中,线粒体凋亡途径同时也受多种miRNA的调控.例如,线粒体融合蛋白(Mitofusion1,Mfn1)是维持线粒体稳态的关键蛋白之一,可以调控心肌细胞中的线粒体分裂和细胞死亡[25].Li等[26]通过建立小鼠心梗模型,发现miR-140通过直接结合在Mfn1的3’UTR来抑制Mfn1的表达.同样地,动力相关蛋白-1(dynamin-related protein-1,Drp-1)是细胞凋亡过程中调控线粒体分裂的关键节点[27],小鼠体内Drp-1的沉默可以显著减少心脏经缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤后的梗死面积[28].据报道,miR-499在心脏缺血性损伤风险区域中下调,心脏中过表达miR-499会抑制由钙调磷酸酶介导的Drp-1蛋白的去磷酸化,从而改善心肌梗死的发病程度[29].Pink1作为丝氨酸/苏氨酸激酶,是调节线粒体分裂/融合的重要基因[30].近期研究发现,E2F1,miR-421和Pink1之间相互作用组成一条信号轴,调控线粒体形态和心肌细胞凋亡[2].MiR-421通过抑制Pink1翻译来促进线粒体碎片化、细胞凋亡和心肌梗死.在线粒体凋亡通路中,由miR-361和PHB1组成的另一条信号轴也可通过抑制线粒体分裂和细胞凋亡来保护缺血损伤的心脏[31].到目前为止,尽管许多调节心肌细胞存活平衡的miRNA已经被挖掘,但心脏中线粒体通路的分子机制仍需不断探索.

其他类型的非编码RNA,如长链非编码RNA(lncRNAs)和环状RNA(circular RNAs,circRNAs)被认为是心血管疾病凋亡途径中新的调节分子.LncRNAs是一组长度大于200 nt的RNA,位于整个基因组中,极少具备编码蛋白的能力[32].LncRNAs具有多种细胞功能,例如捕获miRNAs、调控转录因子和影响染色质的三维结构[33-34].同时,lncRNAs参与多种生物过程,包括染色质修饰、基因组印记和细胞命运等[35].例如,lncRNA-Braveheart和Fendrr在心肌细胞分化过程中发挥关键作用[36-37].然而,关于lncRNAs在心肌细胞死亡中所起作用的相关研究目前比较有限.近期研究发现了一个心脏细胞凋亡相关的lncRNA(cardiac apoptosis-related lncRNA,CARL)可作为一种内源性的miR-539吸附海绵[38].MiR-539可直接靶向PHB2,而PHB2的抑制可促进线粒体裂变和细胞凋亡[38].CARL能够通过调节miR-539/PHB2途径来抑制线粒体分裂和细胞凋亡.另一类非编码RNA,环状RNA(circRNAs)的3’与5’端可以连接起来形成一个封闭的环形[39].已有研究指出,cirRNAs参与多种细胞调控过程,通过碱基互补配对作为miRNAs的一种竞争性内源RNA[40].然而,circRNAs在心肌细胞凋亡中的作用还有待研究.到目前为止,只有一个心脏相关circRNA(heart-related circRNA,HRCR)被鉴定为凋亡途径的潜在调节分子[41].在该研究中,HRCR通过直接结合miR-223并抑制其活性而作为内源性miR-223海绵.MiR-223主要通过抑制抗凋亡蛋白Arc来促进心肌肥大和心脏衰竭.抗凋亡蛋白Arc是具有Caspase募集结构域(Caspase recruitment domain,CARD)的凋亡抑制因子,在心脏中高度表达并且抑制细胞凋亡[42-43].

2 非编码RNA调节心肌细胞自噬

自噬是一种保守的细胞内循环过程,主要是失去功能的蛋白质和细胞器被运送至溶酶体进行降解的过程[44].细胞通过自噬可以将生成的大分子再循环释放到胞质中以供生物合成途径中的重复使用.自噬通过两种主要途径调节：Beclin-1和mTOR信号通路.

自噬通常用于维持细胞稳态,其功能障碍可导致心血管疾病.自噬功能障碍会影响心肌细胞线粒体的更新,从而导致心脏能量供给的缺乏[45].到目前为止,已经有多种miRNA被证实与自噬途径和心脏病理学相关联.由Beclin-1激活的自噬可诱导细胞死亡和心脏紊乱.例如,ARC作为Beclin-1的抑制剂,在压力超负荷引起的心衰中,减少了自噬细胞的死亡和心梗梗死面积[46].生物信息学分析和进一步的实验表明,miR-325通过靶向ARC干扰自噬途径.有趣的是,miR-325作为转录因子E2F1的下游起作用.另一项研究发现,血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)会导致miR-30a表达下调,Beclin-1作为miR-30a的靶蛋白被释放出来,导致细胞过度自噬以及随后的心肌细胞肥大.细胞中miR-30a的类似物可以通过抑制Beclin-1的表达从而逆转AngⅡ诱导的心肌肥大[47].另一方面,抑制mTOR的活性能够促进自噬和动物心梗[48].在心衰时,miR-221通过调节p27/CDK2/mTOR轴干扰自噬平衡和心肌重塑[49].MiR-99a的过表达能够减弱mTOR的活性,减少心肌梗死面积并改善心功能[50].

在临床上,肥厚型心肌病患者和健康捐赠者心脏组织的miRNA芯片结果显示,在疾病状态下miR-451的表达水平下降[51].但是,过表达miR-451时,靶蛋白结节性硬化症复合体1(tuberous sclerosis complex 1,TSC1)会加速心脏肥大,这是一种已知的自噬正调节剂.在另一项研究中,心肌细胞特异性过表达miR-212/132会影响正常的自噬反应并通过负调节叉头转录因子3(forkhead box O3,FOXO3)的表达,导致促肥大钙调神经磷酸酶活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)途径的过度活跃.最近,miR-22被鉴定作为心脏自噬的抑制剂,被认为是有开发潜力的临床心肌梗死的治疗和预后工具[52].近期研究发现,lncRNAs也参与心肌细胞自噬的调节过程.一个名为自噬促进因子(autophagy promoting factor,lncRNA-APF)的lncRNA被发现[53],该lncRNA具备miR-188-3p的结合位点.进一步的实验揭示APF,miR-188-3p和自噬相关蛋白(autophagy related protein 7,ATG7)构成了一个新的心脏自噬程序调节轴,影响自噬细胞死亡和心肌梗死.

3 非编码RNA调节细胞坏死相关的心血管疾病

细胞体积增加、细胞器肿胀、质膜破裂和细胞内容物泄漏是坏死的形态学特征[54].长期以来,坏死通常被视为被动、偶然和不受管制的事件.近年来,越来越多的证据表明,坏死也可以由细胞编程.最近,一种相对新形式的坏死被定义为程序性坏死或坏死性凋亡,主要依赖受体相互作用蛋白激酶1(receptor interaction protein kinase 1,RIP1)和RIP3的独特信号转导途径[54-55].在心肌细胞中,坏死诱导的细胞内容物释放会引发炎症反应及病理反应,如心肌梗死和心力衰竭[56].心脏的缺血性损伤经常导致细胞内钙超载和ATP消耗,随后导致线粒体的线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)开放.亲环蛋白D(cyclophilin D),是mPTP的关键调节因子[57].抑制小鼠中的cyclophilin D能减少I/R损伤后的梗死面积,并且还有助于抵抗线粒体通透性的转变[58].已有研究发现,miR-30b通过靶向抑制cyclophilin D的翻译来减弱cyclophilin D诱导的心肌细胞坏死[59].此外,E2F1可负调控miR-30b的表达,表明由E2F1,miR-30b和cyclophilin D组成新的坏死调节信号轴[59].心肌细胞祖细胞(cardiomycyte progenitor cells,CMPCs)为受损心肌提供潜在的细胞来源.当CMPCs暴露于H2O2时,miR-155的表达上调,过表达miR-155时,可以阻断RIP1,从而引发抗坏死反应.该发现揭示了miR-155可作为移植疗法的治疗靶标[60].近年来,一些研究小组提供了调节心肌细胞坏死发病机制的复杂信号转导机制的一种新见解.Fas相关死亡结构域蛋白(Fas-associated protein with death domain,FADD)负调节RIP1-RIP3复合物和坏死的形成[61].MiR-103/107通过干扰FADD的表达进而影响心脏中氧化应激诱导的细胞坏死和心肌梗死面积.进一步的生物信息学分析发现,lncRNA-H19含有miR-103/107的识别位点.细胞中过表达或敲低H19的实验证实,H19的表达与细胞对坏死死亡模式的敏感性之间呈负相关.进一步揭示了一种调节心肌细胞坏死样凋亡的新通路,该通路由H19,miR-103/107和FADD组成[62].最近,由p53/lncRNA-NRF/miR-873/RIP(NRF为核呼吸因子,nuclear respiratory factor)组成的信号轴引起了研究者的关注[63],在该信号转导通路中,p53转录激活lncRNA-NRF,而NRF可作为miR-873的内源性吸附海绵,从而抑制RIP1//RIP3的翻译.lncRNA-NRF的过表达会导致心肌细胞坏死性死亡和I/R损伤后心肌梗死面积的增加.

4 三种细胞死亡模式之间的相互作用

在不同的应激条件下,细胞会发生凋亡、自噬和坏死.在通常情况下,轻度应激条件诱导细胞发生自噬；而在进行性应激条件下,细胞发生程序性凋亡；在进一步的极端环境中,ATP消耗与细胞坏死同时发生[64].线粒体通常作为细胞自噬和凋亡模式切换的转换器[64],因此同一个细胞应激因子可以同时激活细胞凋亡和自噬的不同信号通路.例如,ROS在细胞凋亡中起关键作用[65],同样地,ROS也可以通过影响Atg4的活性诱导细胞自噬[66].此外,信号通路的某些节点基因,如Beclin-1/Bcl-2[67],p53[68]和caspase-8,在细胞凋亡/自噬/坏死之间的转换中起作用.Nix是一种Bcl-2家族蛋白,可以介导细胞凋亡或坏死[69].另一项研究指出,Bax/Bak是Bcl-2家族的其他成员,已知Bax和Bak在I/R损伤时激活细胞凋亡,它的沉默导致抵抗mPTP开放和坏死[70].

某些miRNA可能同时参与不同的细胞死亡过程.例如,miR-497可抑制抗凋亡蛋白Bcl2和自噬基因LC3B,促进细胞凋亡并减少细胞自噬的发生[71].Let-7b通过抑制caspase-3,进而抑制移植到I/R损伤心脏中的人间充质干细胞的凋亡和自噬[72].Sirt1是miR-34a的靶点,并且能够通过p53和ROS信号途径影响细胞凋亡.此外,Sirt1通过调节p53和FOXO转录因子的活性参与自噬[73].

5 展望

心血管疾病的发展是一个涉及多种细胞过程的复杂过程.本工作揭示了非编码RNA通过参与细胞的凋亡、自噬和坏死相关的信号通路从而调控心肌细胞的存活/死亡,具备广泛应用于临床治疗心脏病的潜力.阻断细胞凋亡或坏死可能是心脏病的有效治疗策略.而且,非编码RNA的类似物或抑制剂易于合成,体内转染的细胞毒性低,有望成为治疗人类心脏病的潜在治疗靶标.但是,基于非编码RNA疗法的发展仍有许多问题和挑战需要解决,例如脱靶效应.目前,一些心血管相关miRNA已被用作心脏病的诊断标志物[74].在未来的研究中,仍需进一步探索在不同心肌病理状态下,非编码RNA和不同心肌细胞死亡形式相关联的复杂机制.