血管衰老中的表观遗传调控

丁杨楠,吕双杰,陈厚早,刘德培

(中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室,北京100005)

衰老作为不可逆的生物学进程,是多种慢性疾病的独立危险因素.随着社会和医疗科技的发展以及人口平均寿命的延长,老龄化问题日趋严重,与之伴随的肿瘤、神经退行性疾病、心血管疾病等衰老相关疾病的发病率也逐年增加,其中心血管疾病已成为世界范围内65岁以上老人的第一致死因素[1],预计到2030年,将有2 360万人死于心血管疾病[2].除直接导致死亡外,心血管疾病也有较高的致残率,预计到2020年,因心血管疾病导致的伤残调整生命年将从1990年的8 500万增至15 000万[3],因心血管疾病所花费的医疗费用及劳动力损失巨大,给社会和家庭造成沉重的负担.

血管衰老是连接衰老和衰老相关疾病的重要枢纽.早在19世纪,现代医学奠基人威廉·奥斯勒(William Osler)就在大量解剖工作的基础上提出了“血管衰老,人即衰老”(A man is only as old as his arteries)的论断,从病理解剖学上说明了血管衰老与个体衰老的重要关系.血管衰老是伴随年龄增长而出现的血管结构和功能的改变,主要包括血管重塑、血管稳态失衡以及血管细胞的衰老.在宏观层面,血管衰老表现为管腔扩张、管壁硬化以及管壁增厚；在微观层面包括血管细胞的衰老和血管稳态的失衡,后者具体表现为血管壁中广泛存在的炎症反应、氧化应激及钙化[4].

机体内基因的正常表达是遗传和环境相互作用、相互平衡的结果,这两种因素的任何一种发生错误,都有可能导致疾病的发生.表观遗传学作为经典遗传学的补充和发展,很好地解释了基因与环境之间的相互作用[5].目前,表观遗传学被定义为在DNA序列不变的情况下基因表达发生的可遗传性改变,其主要机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA的调控和染色质重塑等.随着年龄的增长,机体所受外界环境的影响逐步累积,相比于遗传因素,表观遗传调控在衰老和衰老相关疾病的发生和发展中可能发挥更重要的作用,因此从表观遗传调控的角度探究血管衰老可有助于更好地理解血管衰老的过程,并找到更好的延缓血管衰老及治疗相关疾病的策略[6].下面将简要地从表观遗传调控主要的三个方面来探讨表观遗传调控在血管衰老中的作用.

1 DNA甲基化与血管衰老

DNA甲基化是在基因层面调控基因表达的最主要的表观调节方式.DNA甲基化主要存在于CpG二核苷酸中胞嘧啶第5位碳原子上,在哺乳动物的基因组中,约有1%的基因含有CpG岛,而其中70%以上的CpG岛可以被甲基化修饰[7].环境因素可在很大程度上影响DNA的甲基化水平,使机体的DNA甲基化水平处于动态变化中[8],一般情况下基因启动子区的高甲基化水平会抑制基因的表达,而基因编码区的高甲基化水平则可促进基因的表达.在衰老过程中往往伴随大量的DNA异常甲基化,而这些异常的DNA甲基化与衰老过程中多种疾病的发生相关[9].

人类全基因组内的甲基化研究表明,DNA的高甲基化状态与衰老相关疾病伴随的慢性炎症密切相关[10].例如,在动脉粥样硬化中,单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)启动子区的低甲基化使MCP-1的表达升高,促进炎症细胞的募集,加速疾病进程[11].在血管衰老的过程中,DNA的甲基化同样也促使血管内氧化应激的发生.编码内源性一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的基因NOS3启动子区在生理状态下甲基化水平较低,而在病理状态下会出现高甲基化,抑制NOS3的表达及NO的产生[12].此外,线粒体过氧化氢产生的重要分子p66Shc的启动子区含有大量的甲基化修饰位点,可通过调节甲基化的修饰来调控基因表达[13-14].细胞外基质结构的紊乱也是血管衰老的标志性改变之一,其中基质金属蛋白酶2和9(matrix metalloproteinase-2 and 9,MMP-2,MMP-9)的活化是引起血管基质降解紊乱的主要原因.而伴随血管衰老过程,MMP-2和MMP-9基因启动子区的去甲基化可引起基因的高表达,从而促进血管细胞外基质降解引起血管重塑[15].

然而,还需要更多的证据支持DNA的甲基化在血管衰老中发挥直接作用,以及DNA层面上的其他类型的修饰是否在血管衰老中发挥作用还有待更多的实验研究.

2 组蛋白修饰与血管衰老

由于组蛋白和DNA的紧密缠绕,组蛋白修饰的改变可局部改变DNA的复制、转录、修复等过程,从而影响基因的表达,是另一种重要的表观调控方式.常见的组蛋白修饰改变包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等.调控组蛋白修饰的酶,如组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)、组蛋白甲基转移酶以及组蛋白乙酰基转移酶等在血管衰老过程中发挥重要作用[16].

基于目前的研究,组蛋白去乙酰化酶,尤其是Ⅲ型组蛋白去乙酰化酶(Sirtuin1-7,SIRT1-7)参与血管衰老的多个层面.核定位的Sirtuins成员(SIRT1,SIRT6和SIRT7)可通过直接的组蛋白位点修饰调节基因转录和基因组的稳定.SIRT1作为Sirtuins家族研究最透彻的分子,在血管衰老的过程中发挥着重要的作用.本实验室的研究工作证明SIRT1通过去乙酰化组蛋白H4K16,抑制内皮细胞的复制性衰老,改善内皮细胞的功能,对抗血管衰老[17].SIRT1还可以使内皮细胞Kr¨uppel样转录因子2(Kr¨uppel-like factor 2,KLF2)的表达升高,使血管内皮细胞处于“vaso-protective”的状态[18].在老龄小鼠的血管平滑肌细胞中SIRT1的表达量下降,平滑肌特异性敲除SIRT1会促进血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)诱导产生的血管衰老[19],能量限制可以使血管平滑肌中SIRT1的表达升高,对抗衰老相关疾病,如腹主动脉瘤[20].此外,平滑肌细胞中SIRT1的激活可以通过抗炎抗氧化而降低血管的僵硬度[21].近期研究发现,内皮细胞的SIRT1可以调节肌细胞血管生成信号的分泌从而提高骨骼肌的健康,补充SIRT1所依赖的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)前体烟酰胺单核苷酸可以改善衰老小鼠血管功能并提升肌肉耐力[22].而核定位的SIRT6则可以保护血管内皮细胞的端粒及基因组DNA,避免由DNA损伤引起的复制能力降低和细胞早衰[23].胞浆或者线粒体定位的Sirtuins(SIRT2,SIRT3,SIRT4,SIRT5)更多地是通过影响代谢和氧化应激相关的酶,间接地参与血管衰老.例如,主要定位于线粒体的SIRT3,其缺失会导致过氧化物歧化酶(superoxide dismutase 2,SOD2)的高度乙酰化和失活,引起线粒体中过氧化物的大量累积,致使血管出现氧化还原稳态的失衡[24].除Sirtuins家族外,其他组蛋白去乙酰化酶也参与血管衰老,如HDAC3可抑制巨噬细胞的激活,缺乏HDAC3的巨噬细胞会更易被白介素4(interleukin 4,IL-4)激活,加速血管衰老的炎症反应[25].抑制HDAC会增加基本的和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)诱导的核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)通路的激活,从而使IL-8的表达升高[26].

越来越多不同类型的组蛋白修饰被发现,如在NOS3的启动子区除了H3K9的乙酰化、H4K12的乙酰化外,还存在多个H3K4的二甲基化和三甲基化修饰[27],这些修饰同样也参与了下游基因的表达调控.未来需要更深入地研究不同类型的组蛋白修饰对于血管衰老的直接作用以及潜在的相互调节作用.

3 非编码RNA介导的表观调节和血管衰老

非编码RNA即不编码蛋白质的RNA,其含量超过全基因组转录的80%以上,包括长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA),microRNA(miRNA)和小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)等[28].全基因组的RNA测序表明在衰老细胞和正常细胞中存在大量差异表达的非编码RNA[29].下面以miRNAs为例介绍RNA介导的表观调节在血管衰老中所发挥的作用.(1)影响血管细胞的衰老：如内皮细胞中miR-217的表达会随机体的衰老而升高,并可结合 SIRT1 的 3’-非翻译区(3’-untranslated region,3’-UTR)抑制 SIRT1 的表达,引起内皮细胞衰老和功能障碍,而抑制内皮细胞中miR-217的表达则可减缓细胞的衰老[30]；miR-145和miR-143可调节血管衰老过程中平滑肌细胞的表型转换,在分化的平滑肌细胞中miR-143和miR-145活化,一方面形成正反馈机制维持平滑肌细胞的活化状态,另一方面抑制平滑肌细胞的增殖[31].(2)调节血管炎症反应：如miR-155是血管炎症的正性调节因子,活化的巨噬细胞和单核细胞会大量表达miR-155,使血管处于慢性炎症状态,同时高水平的miR-155会促进MCP-1的表达,募集更多的单核细胞,进一步加剧炎症反应[32].相反,miR-194可以抑制炎症,过表达miR-194可以通过抑制肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)减少单核细胞炎症因子的产生[33].(3)调节血管钙化：miR-135a,miR-762,miR-714和miR-712可通过抑制钙离子的外流促进血管钙化,而miR-125b可通过抑制血管平滑肌细胞的骨化而抑制血管钙化[34].(4)调节血管氧化应激：如miR-210可以抑制细胞色素C氧化酶同源组装物10(cytochrome c oxidase assembly homolog 10,COX10)的表达,而COX10的表达量下降抑制了线粒体复合物Ⅰ和Ⅳ的活性,从而调节线粒体活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的产生[13,35].(5)影响血管重塑：如miR-106a可通过调节转录因子Ets-1来抑制MMP-2的表达,而随着年龄的增长,miR-29b表达的升高会使MMP-2/MMP-9的表达升高,活性增强[36-37].此外,miR-181b可以负性调节金属蛋白酶组织抑制因子3(metalloproteinase tissue inhibitor 3,TIMP3)的表达以及弹性纤维的产生[38].

RNA分子通过多种机制在衰老相关的心血管疾病中起着重要的调节作用,这在文献[39]中已有阐述,未来需要阐明更多的不同类型RNA分子在血管衰老中的调节作用.

4 表观遗传调控与血管衰老的治疗

如前所述,血管衰老包括血管重塑、血管稳态失衡以及血管细胞的衰老,各层改变之间相互交错,大大增加了血管衰老过程的复杂性.因此,单独针对一种血管细胞或血管衰老的单一生物学过程很难有效延缓血管衰老.而表观遗传调控参与了血管衰老的多个层面,如果以此为血管衰老和相关疾病的治疗靶标可能会更有效.而且已知绝大多数的表观遗传修饰都是可逆的,对表观遗传调控的这种适应性特征加以利用,将有可能从表观遗传角度开发新的治疗策略.

基于表观遗传的靶向药物受到了广泛的重视,目前已经有多个重要的表观修饰蛋白的靶向抑制剂在临床上有较好的应用,例如已经进入临床应用的有DNA甲基转移酶1的抑制剂和HDAC抑制剂等,多个正在进行临床实验的有EZH2抑制剂、DOT1L抑制剂和BRD4抑制剂[40].由于SIRT1表达及活性的升高可减缓衰老相关的疾病,因此SIRT1激活剂也成为一种潜在干预疾病的药物,多项研究表明SIRT1的激活剂白藜芦醇和小分子化合物SRT2104,SRT1720等可有效延缓小鼠和大鼠的血管衰老[41-44].SRT2104和SRT2379是2型糖尿病、肥胖和代谢综合征以及银屑病等疾病的潜在治疗药物[45-46],但是是否有延缓人的血管衰老的作用还有待研究.其他类型的表观遗传靶向药物在血管衰老中的作用也有待进一步开发验证.除此之外,能量限制作为唯一的可延长健康寿命的非药物干预手段,已被证实可改善多种动物模型的血管衰老[20,47],因此如何更好地开发能量限制的模拟物也受到越来越多的关注[48].

衰老研究的最终目的是延长人类寿命,延缓相关疾病的发生.本实验室将整体衰老分为4个密不可分的层次,即生物的生理机能衰退,疾病易感性增加；系统性的免疫、代谢和内分泌失调；细胞功能发生故障；生物分子的维护出现问题[49].系统层面的紊乱与细胞层面和分子层面的失真互为因果,是生理机能衰退的病理基础,使得衰老的机制具有明显的复杂性.细胞衰老与整体衰老之间的关系错综复杂,充分阐明细胞水平和机体整体衰老对于开发有效的干预血管衰老以及相关疾病的方法意义重大.本研究团队将细胞水平衰老对于整体衰老的贡献定义为“senescaging”[4],主要包括传统的增殖活跃细胞和增殖不活跃细胞,如心肌细胞和神经细胞等在衰老过程中对于整体衰老的生理和病理作用.但在正常的衰老个体血管组织中,衰老细胞的实际数量很少,这些衰老细胞的存在会在某些危险因素刺激下改变血管局部微环境,增加了衰老相关疾病的易感性,加速了血管衰老的发生进程[50],但其具体机制还有待于进一步阐明.因此,研究细胞水平的衰老对于血管组织衰老的贡献及其表观调控相关的具体机制,将有可能为延缓血管衰老提供更多思路.

5 总结和展望

虽然近二十年来对表观遗传调控分子机制的解析得到了突飞猛进的发展,但表观遗传调控的复杂性与精细性可能远超目前所发现的内容.为了能够更好地从表观遗传层面延缓血管衰老,还需在新的表观调节方式和新的实验研究技术手段上有更大的突破,提高表观遗传调控的分辨率.例如,近年来发现的RNA的甲基化修饰和逐步发展起来的单细胞测序和单细胞表观基因组学,scBS-seq,scATAC-seq,scDNase-seq,scNOME-seq,scMNase-seq和scChIC-seq等技术的开发和应用,展示出单细胞层面的表观调控模式[51-54].揭示更精细的表观遗传调控模式,有望更精准地开发出表观调控相关药物,以应用于血管衰老及相关疾病.