肌萎缩侧索硬化中抗氧化应激通路的研究进展

田亚萍，张 玲2，黄振强2，于继徐，车峰远

(1 临沂市人民医院，山东 临沂 276000；2 临沂市中医医院)

肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一种慢性进展的致死性神经系统退行性疾病，上下运动神经元均可受累，常以肌无力和肌肉萎缩为最初起病形式，逐渐进展为延髓麻痹及锥体束受累表现，多于起病3-5年内因呼吸肌受累出现呼吸困难、夜间睡眠呼吸暂停，最终出现呼吸衰竭死亡。按其起病方式，可分为散发性ALS(SALS)和家族性ALS(FALS)两种，其中5%～10%的ALS具有家族遗传史，目前证实的与ALS相关的基因仍十分有限。ALS已知的致病危险因素包括最常见的4种基因突变、tau蛋白异常及环境变异等。4种基因分别是：C9ORF72基因、铜/锌超氧化物歧化酶1(SOD1)基因、反向激活反应DNA结合蛋白基因(TARDBP)和肉瘤熔合基因(FUS) ，占全部FALS的70%，而占SALS的10%～11%，其中SOD1基因突变约占家族发病人群的15%，C9ORF72重复核酸扩增在家族型发病人群中占45%，FUS和TARDBP在家族型ALS占比均可达4%。证据明确显示，反向激活反应DNA结合蛋白43(TDP-43)是除SOD1外的另一可能致ALS的蛋白质，TARDBP基因突变是因导致TDP-43蛋白的异常沉积而致病。研究表明，RNA代谢异常是ALS主要机制，在所有非SOD1介导的ALS疾病均有RNA剪切过程参与，C9ORF72突变导致的ALS在家族性ALS中比例最高，也与RNA代谢关系也最为密切。FUS和TARDBP是一个多功能的DNA和RNA结合蛋白，参与RNA转录、选择性剪接及mRNA稳定性调节。而不论何种原因导致的RNA代谢异常均会损伤细胞抗氧化应激能力，因而被认为是运动神经元变性的一个主要因素。

1 Nrf2/ARE抗氧化应激信号通路

神经变性病有着不同的病理特征，如异常蛋白聚集，小胶质细胞增生，巨噬细胞聚集，及线粒体功能障碍等。目前证据表明[1]，抗氧化应激能力受损、谷氨酸兴奋性毒性增加、线粒体功能障碍、异常蛋白聚集、细胞骨架异常及遗传因素等一系列纷繁复杂的因素之间相互作用共同导致了ALS运动神经元的进行性丢失，其中，抗氧化应激能力受损被认为在运动神经元变性过程中发挥着主要作用。核因子NF-E2相关因子(Nrf2)与抗氧化反应元件(ARE)相互作用，简称Nrf2/ARE信号通路，在此通路作用下调节抗氧化反应酶和抗氧化反应蛋白(包括醌氧化还原酶1和血红素氧合酶)的作用和生成，这被认为是目前发现的最为重要的一种内源性抗氧化应激通路。在正常状态下，Nrf2在细胞浆中与其抑制性蛋白Keapl相连接，不具备活性能力。在细胞受到氧化应激刺激时，在氧自由基的作用下促使Nrf2与Keapl蛋白相互解离，引发Nrf2分子聚集并由胞浆转位到胞核内。在胞核内，Nrf2与Maf、ATF4、cJunD、JunD等反式作用元件结合组成杂化二聚体，与核内相应顺式作用元件ARE的启动子部位结合，进而启动Nrf2下游靶基因，如谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)、过氧化氢酶(CAT)等表达，来上调Ⅱ相解毒酶及抗氧化蛋白等的表达。NQO1是一种真核生物细胞中普遍存在的黄素蛋白酶，能够调节细胞内物质使之处于还原形态，如能参与醌类及醌的类似物的还原过程，且在反应过程中不产生单电子还原产物半醌及氧化自由基等氧化产物，因此在氧化应激过程中发挥保护作用。此外，NQO1是Nrf2通路上的特异基因，而HO-1不是，此点可利用NQO1的表达情况判断某种物质或基因突变是不是针对Nrf2通路的改变，这点非常重要[2]。

实验证据证明，突变基因破坏了Nrf2介导的下游信号通路，会加剧细胞内炎症介质反应、引发氧化损伤并导致线粒体功能障碍[3]，而Ⅱ相酶诱导剂的添加相应的可以调节Nrf2/ARE通路并上调HO-1的表达，进而发挥保护神经元细胞的作用，使其免受氧化应激带来的损伤。也就是说，Nrf2/ARE信号通路可以对抗氧化应激反应发生进而保护神经元细胞。不仅如此，在除神经元细胞外的不同组织和器官中，Nrf2/ARE信号通路的激活都能对机体起到保护或者减少细胞氧化应激损伤[4]。不过，目前Nrf2/ARE信号通路在ALS运动神经元变性的致病过程中所发挥的具体机制仍然未完全明确。

将转染人突变的SOD1基因转染到小鼠身上同样表现出ALS样症状。在应用NSC-34细胞构建的肌萎缩侧索硬化细胞模型实验中[5]，转染hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-)的细胞内MDA的水平明显高于野生组、空转组及正常组细胞，在蛋白和基因表达水平上，Nrf2表达量明显低于野生组、空转组和正常组，相对应的下游抗氧化应激蛋白HO-1和NQO1表达也明显减少。该实验进一步研究发现，在蛋白表达水平上，突变型细胞胞浆中Nrf2的表达明显减少，而胞核中Nrf2蛋白与空转组相比却显著增加。在另一项基于NSC-34细胞构建的关于突变人TDP-43质粒转染获得的肌萎缩侧索硬化细胞模型实验中，笔者有着同样的发现[6]，细胞内MDA的水平明显高于野生组及空转组细胞，在蛋白表达水平上，Nrf2表达量明显低于野生组和空转组，相对应的下游抗氧化应激蛋白NQO1表达也明显减少；突变型细胞胞浆中Nrf2的表达明显减少，而胞核中Nrf2蛋白与空转组相比却显著增加。与此同时，发现了在Nrf2/ARE通路上相关的小Maf蛋白和Jun二聚化蛋白2(JDP2)，在突变组表达也是减少的。这两项研究与使用ALS动物模型实验得到的结论是一致的，即ALS运动神经元细胞存在Nrf2核内积聚，提示：当细胞遭受氧化应激反应时，突变组细胞中有更多的Nrf2由胞浆移位到胞核中发挥作用，但是最终转入核内发挥作用的Nrf2及被激活的抗氧化酶却是减少的，这点是目前不能解释的，不过也说明了因为基因突变导致的Nrf2/ARE信号通路出现功能障碍，才使得通路下方的表达受到影响。

进而，在Nrf2/ARE信号通路的调控机制研究中发现，影响Nrf2的相关信号通路虽不尽相同，但目前比较一致的观点是Nrf2水平的转录后调节机制受如PKC、MAPK、PI3K等细胞内重要信号转导途径的作用。

简单来说，Nrf2的激活方式有3种：(1)改变Keap1的蛋白构象使得其与Nrf2解耦联，主要是通过修饰氧化剂或亲电子剂的半胱氨酸巯基键。(2)使得Nrf2中的丝氨酸和苏氨酸磷酸化进而与Keap1解偶联。主要由一系列细胞外信号途径中激酶的活化相互作用发生，包括蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)、细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun N端蛋白激酶(JNK)及P38丝裂原活化蛋白激酶(P38-MAPK)等。(3)通过上调Nrf2 mRNA水平使Nrf2蛋白表达升高也是存在的，如纤维生长因子家族里的成纤维细胞生长因子-1(FGF-1)、FGF-7、FGF-10就是通过这种方式，使得处于活性状态Nrf2增多。研究证明，使用ERK、JNK和P38激酶的抑制剂可阻止Nrf2核转位。离体实验研究表明，姜黄素可以通过干预MAPK信号通路来解离Nrf2-Keap1复合体，实现Nrf2由胞浆向胞核的转位分布，是Nrf2/ARE信号通路的激活剂。前两种激活方式都属于转录后修饰，是因Nrf2-Keap1解离来升高Nrf2蛋白含量，并未影响Nrf2在mRNA的转录水平。

Nrf2在被亲电子试剂或蛋白激酶路径等激活以后，处于游离状态的Nrf2数量增多，发生胞核内移位。经跨核膜转运入核后的Nrf2必须与Maf、JunD、ATF4等转录因子结合，形成异源二聚体，再结合到ARE的启动子上，才能指导下方Ⅱ相解毒酶基因的表达。在形成杂化二聚体时，以Maf蛋白为例，研究发现，Maf识别元件(MARE)、Nrf2结合位点及ARE序列三者非常相似，因此才提出Maf家族的转录因子及CNC蛋白的某些成分可以和ARE相匹配组合，并在Nrf2-KO基因的小鼠实验中证实了小Maf蛋白和Nrf2复合体与ARE通路的激活有关。此外，在Ⅱ相解毒酶诱导实验中也发现Nrf2对ARE不仅有很强的特异性结合能力，还对此通路发挥正向调控作用。活化因子蛋白1(AP-1)家族中一些其他的如PKC、Jun、Maf G/K、C-Jun和C-Fos等正负调控因子对Nrf2/ARE信号通路也有调节作用。需指出，小Maf蛋白的自身过表达容易导致自身之间形成同源二聚体而抑制ARE驱动这整个基因表达的进程。

另有研究表明，Nrf2被其它各种激酶的磷酸化作用也影响了Nrf2的分布。PI3K途径增加Nrf2核易位所需的细胞Ca2+；Nrf2激活和C/EBPb和PPARy(过氧化物酶体增殖物激活受体)和RXR组成的异质二聚体的激活相协调，通过基因的反式激活协调作用有助于诱导二相解毒酶基因表达。Nrf2的稳定性也可以由DJ-1(一种癌症和PD相关蛋白质)来调节，DJ-1阻止Nrf2和Keap1的连接，促进二者分离，从而防止Nrf2泛素化和退化。Nrf2-ARE激活导致一系列的内源酶的产生，这些自由基清除酶是一种强大的抗氧化剂防御机制。缺少DJ-1/PARK7可导致NQO1减少，NQO1的减少归因于Nrf2的损失。

2 Maf蛋白

RNA聚合酶参与真核生物基因的转录起始过程中，而转录因子因为是RNA聚合酶的辅助因子，因而具有不可或缺的作用。转录因子是起正调控作用的反式作用因子，且无转录因子基因则处于不表达状态。Maf家族蛋白是机体重要的转录因子，主要在细胞核内起作用，在细胞蛋白的表达，细胞分化和凋亡等方面均发挥着重要作用。Maf家族蛋白均是由两部分组成，b-Zip基因序列和保守的碱性结构域，前者介导Maf与具有b-Zip基序的蛋白质结合，后者使Maf与特异的DNA序列结合。小Maf蛋白属于Maf家族蛋白，它的特殊点在于缺乏具有转录活性的结构域，却能和其他具有转录活性的b-Zip类型蛋白如AP-1家族蛋白相组合，发挥正向转录调节作用。AP-1(c-Fos、c-Jun)、CREB、CNC蛋白、NF-E2核因子(Nuclear factor erythroid 2)的大亚基P45、Nrf1和Nrf2等均是细胞内的转录激活因子。小Maf既可作为伴侣蛋白与这些转录因子形成异聚二聚体，再与基因序列上特异的顺式作用元件结合，促进基因转录；还可以作为转录的抑制者，通过自身形成同源二聚体，抑制基因转录。

Maf识别元件(MARE)是被Maf家族蛋白识别的DNA特异序列。MARE包括两种形式，一种是TPA应答元件(TRE)型MARE(T-MARE)，另一种是cAMP应答元件MARE(C-MARE)。两者具有相似的核心序列，两翼均有GC对称结构，仅相差一个碱基。Maf家族蛋白均以高度亲和力通过保守的碱性结构域与这两种反应元件的两翼-GC序列结合；而AP-1家族蛋白中的c-Jun、c-Fos或者CREB结构则与MARE的核心序列相结合。在上文提到，NF-E2的DNA结合部位及ARE与T-MARE十分相似，因而可被小Maf蛋白识别。

小Maf蛋白缺少具有转录活性的区域，因而作为伴侣蛋白被发现。在研究核红系特异性转录因子NF-E2功能时发现，它的作用区域是和转录因子CNC家族中的P45蛋白与Maf家族中的P18蛋白(MafK)结合，进而发挥功能的，因而MafK以这种方式被首次发现。之后，MafK mRNA被检测到在很多组织中都有表达，但mRNA表达水平因组织不同而不同，并常在组织发育的早期阶段大量且短暂表达。MafK作为小Maf蛋白家族的一员，同样在蛋白过量表达时，自身会聚集形成同源二聚体并抑制相关基因的转录进程；假如与P45蛋白量合适则形成二者的异源二聚体，促进基因转录。当细胞受到一些物理化学刺激时，诱发机体一系列抗氧化应激反应，最重要的就是Nrf2/ARE通路的激活。胞核内Nrf2与小Maf蛋白等形成异源二聚体，结合抗氧化反应元件ARE，启动依赖ARE的二相解毒酶基因和抗氧化基因如NQO1的转录，发挥保护神经元、抗炎、抗肿瘤等重要功能。过度表达MafG、MafK可以抑制NQO1等基因的表达大概也是这个原理。同时，在以斑马鱼为模型的实验中发现了新型小Maf蛋白-MafT，它也可首先自身形成同聚二聚体或与Nrf2、P45-Nrf2形成异聚二聚体，再与MARE等作用元件结合，发挥对细胞的防御调节功能。综上所述，Maf家族蛋白在体内的功能十分重要并广泛，小Maf家族蛋白作为整个家族的重要一部分，也抑制或辅助其他转录因子家族发挥调节转录的功能。目前，这些研究还都处于认识的基础阶段，有关Maf家族蛋白的其他功能还需进一步深入研究。

3 JDP2蛋白

JDP2是从c-Jun的结合蛋白中分离出来的蛋白质，属于转录AP-1的一部分。JDP2是含有一个碱性亮氨酸拉链结构(bZIP)并包含163个氨基酸的蛋白质。JDP2作为一种广泛的AP-1抑制蛋白被逐步认识。亮氨酸拉链是一种重要的结构膜体，首先在酵母转录因子Gcn4中发现，由C端的亮氨酸二聚化结合区和N端的碱性DNA结合区组成，见于多种转录因子。AP-1是亮氨酸拉链蛋白，由Jun蛋白家族(Jun, Jun-B, Jun-D)、Fos蛋白家族(Fos, FosB, Fra-1, Fra-2)、Maf蛋白家族(c-Maf, MafB, MafA, MafG/F/K)和ATF蛋白家族(ATF-2, ATF-3, B-ATF)组成。哺乳动物中AP-1的主要成分是Jun和Fos，其中Jun的酵母同源物是Gcn4，两者识别相同的DNA结合序列，也就是TRE，其他的识别元件还有CRE、MAF或ARE。Jun蛋白的结构高度同源，但其表达模式和功能不相同。JDP2是第一个被分离出的c-Jun抑制蛋白，当时是从特殊酵母双杂交SOS募集系统(SRS)中提取出来的。人的JDP2基因定位于14q24.3，在人类、小鼠及大鼠间具有很高的同源性。

JDP2作为一种广泛的AP-1抑制因子，可以形成同源二聚体，也可以和其他AP-1家族转录因子，主要是Fos和Fras结合形成更稳定的异源二聚体，也可同AP-1家族外的CREB/ATF/Maf结合，从而抑制这些转录因子的转录活性。此外，JDP2不仅能通过改变染色质结构调控基因转录，还能募集组蛋白去乙酰基酶，或直接与组蛋白结合，抑制组蛋白的乙酰化，从DNA、染色质、蛋白质等多个水平调控基因的表达，在细胞的众多生理及病理反应中起到重要作用。JDP2首先被发现可以促进肌肉细胞的分化，之后在肿瘤中的研究逐渐增多。正如Heinrich等发现，在所检测的选自7种不同部位不同类型的53例恶性肿瘤标本中，达35.8%的癌组织标本显示JDP2的表达水平均有程度不一的下降，且只有5.8%的标本实验显示了相反的结果，从数据显著差异中大体表明在癌组织中JDP2表达减少，发挥的抑制作用减弱。另外，在小鼠胚胎瘤模型细胞中发现，JDP2对维甲酸(RA)诱导的F9细胞分化具有抑制作用，间接表明该分化过程主要被c-Jun基因表达上调介导，由于对癌细胞有抑制分化作用，这项重要发现被在不同肿瘤中广泛研究。作为一种调节蛋白，JDP2不仅可以通过结合于特异的DNA序列抑制启动子活性在转录过程发挥作用，还可以在转录后水平通过影响组蛋白修饰，改变蛋白质结构达到抑制基因表达目的。因JDP2/JDP2或JDP2/ATF2复合体均可结合到cAMP反应元件上，使ATF-2介导的转录激活过程受到抑制，将JDP2过度表达已被作为一种抑制AP-1转录激活的方法，受到适当应用。JDP2可能是通过调节AP-1活性在靶基因的转录过程中发挥抑制作用，从而参与机体的生理和致病过程。对JDP2研究的逐渐深入也丰富了人们对AP-1调控基因转录家族的认识。

有研究表明[7]，JDP2作为基因转录中的辅因子，在Nrf2/ARE/MafK介导的抗氧化应激转录通路中起着至关重要的作用。JDP2直接结合在ARE反应元件的核心序列上，与Nrf2-MafK通过基本的亮氨酸拉链区域结合，促进Nrf2-MafK复合体启动DNA活性，进而与ARE反应元件结合并促进ARE相关基因的表达。在基因敲除JDP2的鼠胚胎纤维母细胞的小鼠模型中，人们发现与ARE相关的基因整体转录水平受损，同时Nrf2激活目的基因的表达能力也受损。此外，JDP2基因敲除的小鼠在应对氧化应激时出现细胞内氧化应激产物的积聚及上皮层的增厚。这些数据表明JDP2作为保护细胞抗氧化应激反应的重要蛋白在体内发挥着重要作用，NQO1等抗氧化应激蛋白的完全表达也依赖于JDP2蛋白的表达。

4 展望

ALS发病机制复杂，各机制间相互联系和影响，最终导致以运动神经系统疾病为主的多系统病程。目前，hmSOD1-G93A突变基因转基因小鼠是目前应用最广泛的ALS模型，比较客观地反映氧化应激对运动神经元的损伤机制。但ALS病因多样，机制复杂，很多致病基因表达的蛋白具备多个功能域，还可以和多种因子相互作用，而且基因敲除和点突变对细胞作用也是不同的，不能完全反应基因突变的致病机制，未来研究中，需要以突变的基因敲入为主，制作更能反映致病机制的ALS模型，便于对ALS发病机制的研究进一步深入和精确化。

Nrf2-ARE信号通路是近几年抗氧化研究领域的热点，同时，它在中枢神经系统的研究已成为焦点。众多研究表明，Nrf2-ARE信号通路在肌萎缩侧索硬化中具有神经保护作用，未来人们期望可以通过更好的动物实验模型，使Nrf2-ARE信号通路对细胞氧化应激保护机制研究得到突破，进而为研究ALS疾病的治疗提供新的思路。