ω-3多不饱和脂肪酸对牙周炎SD大鼠骨细胞中TNF-α的影响

段金成1，徐丽丽，李 玲1， 公爱梅1， 刘 玮1， 丁继芬

(1 临沂市人民医院，山东 临沂 276003；2 山东医学高等专科学校)

多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)是人体必需脂肪酸，主要包括ω-6和ω-3系脂肪酸。二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)和二十碳五烯(Eicosapntemacnioc acid，EPA) 是ω-3PUFAs中的两个成员。临床研究发现，ω-3PUFAs可以调节机体的炎性反应和免疫功能[1]，对人类的某些特异性疾病，尤其是一些以炎症为主要致病机制的疾病有着较好的治疗效果，如关节炎、牙周炎等[2-3]。本文采用实验性牙周炎的大鼠模型，通过腹腔注射给与不同的实验药物，应用免疫组化的技术方法评价PUFAs对大鼠牙周炎的治疗作用，并进一步探讨其作用机制。

1 材料和方法

1.1实验动物及分组 选用6～8周龄健康雄性SD大鼠30只(昆明医科大学动物中心提供)，体重180～220 g，将其按照随机数字法分为3组：正常对照组(N组)、生理盐水组(P组)、EPA组(E组)。分笼饲养，统一饮食摄水。

1.2牙周炎模型的建立 适应性喂养1周后，在3%戊巴比妥纳腹腔注射(1 ml/kg)全身麻醉下，对E、P组大鼠双侧上颌第2磨牙环牙颈部用5/0#慕斯丝线结扎，使丝线尽量位于龈沟内，颊侧打结。从结扎当天开始，用菌液浓度为1.5×108CFU/ml的牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis，P.g)隔日1次进行接种，P.g菌液由云南省口腔医院提供，每只大鼠口内于龈沟内种菌0.1 ml，连续用药2周。N组大鼠不予任何处理。

1.3牙周炎模型的确立 随机抽取P组大鼠，通过组织学观察发现牙龈结合上皮与牙体分离，牙周胶原纤维排列紊乱，有炎症细胞浸润，牙槽嵴顶吸收破坏，以此来确认牙周炎动物模型的建立，见封三图1。

1.4给药方法 牙周炎模型成功后，N组不做任何处理；P组经腹腔注射1 ml生理盐水；E组给予EPA 1 ml(0.3 mg/ml)，每天1次。给药4周。

1.5指标检测

1.5.1口腔检查 给药4周后，分别在3%戊巴比妥那全身麻醉下，检测各组大鼠双侧第2磨牙牙周探诊深度(Probing depth，PD)：采用自制大鼠牙周探针测量各组大鼠双侧上颌第2磨牙腭侧近中、正中、远中3个位点的PD值，取两侧PD的均数作为该鼠的平均PD值。

1.5.2标本采集 在麻醉状态下，脱颈法处死大鼠，在上颌中线处将上颌骨分开，随后将双侧上颌骨浸泡于4%多聚甲醛溶液进行固定，用于组织学的检测。

1.5.3组织学检测 取单侧上颌骨，在0℃～4℃条件下置于4%多聚甲醛固定液固定24 h，15%EDTA脱钙液脱钙3～4周，每周更换脱钙液2次，每日摇荡脱钙液1次，每次1 min，刀切法检测脱钙终点。系列乙醇脱水，二甲苯置换至石蜡包埋，近远中向连续5 μm厚石蜡切片，行TNF-α的免疫组化染色。

2 结果

2.1各组PD的比较 4周后，N组PD为(0.45±0.04)mm，P组为(0.82±0.08)mm，E组为(0.48±0.02)mm。3组比较有统计学意义(F=150.83，P<0.01)，两两比较显示，P组与N、E组有统计学意义(q=20.32，22.11；P<0.05)，N组与E组之间比较无统计学意义(q=1.79，P>0.05)。

2.2组织学观察 光学显微镜下观察，以TNF-α为第一抗体，阳性细胞细胞质均被染成棕褐色或棕黄色，其余细胞胞浆均无棕色着色(见封三图2a)，用PBS代替一抗作为阴性对照，阴性对照组所有的细胞胞浆均无棕色着色(见封三图2b)。

2.2.1TNF-α的阳性表达 给药4周后，炎症区牙槽嵴顶处骨细胞中，P组阳性骨细胞表达较多，而且颜色较深，一般有12～16个表达的骨细胞；E组阳性骨细胞有少量表达，一般在5～7个左右(见封三图3)。

2.2.2TNF-α阳性表达的光密度值变化 给药4周后，各组大鼠炎症区牙槽嵴顶处骨细胞中TNF-α阳性表达的光密度值，N组为(0.26±0.04)，P组为(0.65±0.06)，E组为(0.37±0.03)。3组比较有统计学意义(F=133.28，P<0.01)，两两比较显示，P组与N、E组有统计学意义(q=19.64，20.34；P<0.05)，N组与E组之间比较无统计学意义(q=0.70，P>0.05)。

3 讨论

近年来研究发现，ω-3PUFAs具有抗炎功能和免疫调节作用，其作用方式主要是通过调节细胞的增殖及反应活性、细胞因子的产生和黏附分子的表达，其机制主要有：①抑制炎症花生四烯酸类代谢产物的产生。EPA或DHA通过竞争脂质过氧化酶(LPO)及环氧化酶(COX-1、2)减少来源于花生四烯酸的炎性递质的释放。②增加细胞膜的稳定性[4]，抑制中性粒细胞的趋化作用和黏附能力，同时增强抗原呈递细胞的功能[5]。③抑制核因子-κB(NF-κB)信号通路，降低促炎因子TNF-α、IL-1和IL-6的表达水平，从而影响炎症反应的发生[6]。有研究表明，DHA或EPA与阿司匹林联合使用可以在一定程度上改善牙周炎患者的临床症状[7-8]。在本研究中，观察到了EPA对牙周炎时牙周组织的炎症有一定抑制作用，通过口腔临床检查、牙周PD及组织观察结果均显示：在相同的时间点，E组与P组相比较，牙周组织的炎症有了较为明显的改善。但其与阿司匹林联合应用对牙周炎的治疗效果还有待于进一步的实验证实。

TNF-α在机体的炎症反应中起着重要的作用，被称为炎症反应的启动因子，可诱导细胞因子和炎性递质大量释放。Sungurtekin等[9]研究证实，ω-3PUFAs可显著降低促炎因子TNF-α、IL-1和IL-6的表达水平，从而达到抑制炎症发生发展的作用。另外有研究表明，炎症因子在骨吸收中有多重影响，其中TNF-α、IL-1、IL-8、IL-17 以及转化生长因子可以促进破骨细胞的形成，加重骨吸收的发生发展[10]。TNF-α还可以通过促进间充质细胞表达的巨噬细胞集落刺激因子和核因子-κB受体活化因子配体调节破骨细胞的生成，间接引起骨吸收[11]。而Flock等[12]研究证实，ω-3PUFAs能通过EPA竞争结合环氧化酶，从而抑制PGE诱导产生TNF-α，减少骨吸收的发生。本研究免疫组化的结果显示：给药4周后，在牙槽骨组织炎症区E组与N组的骨细胞中TNF-α阳性细胞表达的光密度值与P组相比较具有明显差异。提示ω-3PUFAs可能是通过不同的途径抑制了细胞因子TNF-α在骨细胞中的表达，从而进一步减少了炎性介质的释放并影响了炎症的发展。

综上所述，ω-3PUFAs对动物实验性牙周炎的临床症状有一定的治疗作用，并且对骨细胞中细胞因子TNF-α的表达有一定的抑制作用。由于上述观点多源于动物实验研究，人体与动物存在较大差别，临床应用较少，因此ω-3PUFAs对牙周病的作用机制及其治疗效果仍有待于进一步深入研究。