EGFR抑制剂耐药拮抗策略在非小细胞肺癌治疗中的进展

何沛敏，童 欣，李冠武

（汕头大学医学院肿瘤分子生物学开放实验室，广东 汕头 515041）

肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，也是死亡率最高，对人类健康威胁最大的恶性肿瘤，其目前的5年生存率只有18.2%.根据组织学特征，肺癌中约85%属于非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）.在临床上，由于缺乏早期发现的有效手段，大部分非小细胞肺癌患者被确诊时已处于晚期，不能进行手术切除，只能选择放疗和化疗，但效果不理想.近年来，在深入了解肿瘤发生的分子机制基础上产生的靶向治疗越来越受到重视.对比于传统的化疗和放疗，靶向治疗对肿瘤细胞更有针对性，具有副作用少、毒性低等优势.目前，针对晚期NSCLC 最成熟的靶向治疗点有表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）、棘皮动物微管结合蛋白4（echinoderm micmtubule associated protein hke 4，EML4）和间变淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）融合基因.而表皮生长因子受体- 酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）就是针对表皮生长因子受体（EGFR）敏感突变的NSCLC 患者，临床上治疗效果明显优于传统的放化疗.故对携有EGFR 基因敏感突变的晚期NSCLC 患者，靶向类药物EGFR-TKI 是首选治疗方案，特别是不吸烟的亚裔女性肺腺癌患者.EGFR-TKI 的一线治疗药物有吉非替尼（gefitinib）等，而厄洛替尼（erlotinib）和埃克替尼（icotinib）等可作为二、三线治疗的药物.

然而经过一段时间治疗后，患者易对EGFR-TKI 产生耐药性，耐药的产生极大地限制了靶向治疗的发展.有研究表明获得性耐药的产生主要跟EGFR-TKI 诱导的自噬（autophagy）活性增强有关.所以，克服EGFR-TKI 的耐药性，要先了解自噬对耐药形成的作用，并针对地干预肿瘤细胞的自噬活性来延缓耐药形成，寻找和发现相关药物（例如自噬诱导剂或抑制剂）来拮抗EGFR-TKI 的耐药性.解决EGFR-TKI 的耐药问题是一个艰辛而有意义的科研任务，研究者可以从自噬诱导或抑制层面获得启发，寻找能拮抗靶向药EGFR-TKI 耐药的方法.本文基于EGFR-TKI 在非小细胞肺癌治疗中的作用机制、其耐药机制及可用自噬调节剂逆转耐药性方面作如下综述.

1 EGFR、自噬与EGFR-TKI的作用机制

EGFR 基因位于人类7 号染色体短臂的12-14 区，包含28 个外显子，其中18～24外显子可以编码该受体的酪氨酸激酶部分.但超过90%的EGFR 突变是发生在19～21外显子，尤其是19 外显子，约占所有突变的60%.而外显子19 碱基缺失和外显子21的点突变往往是对EGFR-TKI 治疗敏感的.突变后EGFR 可不依赖表皮生长因子EGF，进行自激活，活性增强.EGFR 作为一种酪氨酸蛋白激酶受体，与相应配体结合后激活酪氨酸激酶（TK），使其磷酸化，激活下游的P13K-Akt-mTOR 通路和SOS-Ras-RAFMEK-MAPK 通路等使自噬减少，同时加速分泌转化生长因子（Transforming growth factor，TGF）、IL-8、Bfgf 和VEGF 等来促进肿瘤生长，使肿瘤细胞获得不死性，进入“疯长- 分裂”的恶性循环模式.所以，EGFR 的过表达或活性增强（突变后）会使得细胞生长加快，自噬受到抑制，导致肿瘤的产生.而靶向药物EGFR-TKI 正是靶向瞄准EGFR 的酪氨酸激酶胞内区，使其活性减弱，增加自噬，达到治疗目的.

自噬是细胞在自噬相关基因（Autophagy associated genes，ATGs）的精密调控下，通过迅速批量分解细胞器和蛋白等细胞内容物以实现物质重新利用，提高在缺氧、饥饿、化疗和靶向药物存在等的不利环境下存活的一种手段[1].在肿瘤的发生发展过程中，自噬起着双刃剑作用.一方面，自噬可以作为人体的自我保护机制，通过清除受损的细胞器，维持细胞内环境的稳态，保护细胞正常生长，并在肿瘤细胞产生后经自噬性细胞死亡等抑制肿瘤的发生；另一方面，自噬可以作为肿瘤细胞生长过程中的一种自我保护反应，在处于缺氧、饥饿、靶向药EGFR-TKI 等不利环境中时，肿瘤细胞通过快速上调自噬水平，分解无用或不急需的蛋白质和细胞器，减慢生长速度，降低消耗，适应改变，这也是EGFR-TKI 产生耐药性的重要原因.

EGFR-TKI 通过可与三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）竞争地结合EGFR 的酪氨酸激酶，也可作为酪氨酸的类似物，阻断酪氨酸激酶的活性，阻止EGFR 磷酸化，进而通过其下游的蛋白激酶B（proteinase B，PKB，又称AKT）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactived protein kinase，MAPK）途径，阻断EGFR 信号通路，抑制肿瘤的生长与转移.

2 EGFR-TKI耐药的分子机制

2.1 EGFR的T790M基因二次突变

在获得性耐药机制中，约50%病例发生T790M 基因突变，减弱了EGFR-TKI 对肿瘤细胞的杀伤作用.EGFR 基因20 外显子的T790M 发生碱基C-T 替换，导致EGFR 中原本的苏氨酸（T）被占位较大的蛋氨酸（M）取代，形成空间位阻，恢复激酶区，使与ATP 的亲和力增加[2].另外，作为管家基因的第790 位密码子，在调节ATP 结构域特异性抑制剂方面起重要作用，而这种突变会使得已有L858R 突变的激酶对ATP 的亲和力更强于EGFR-TKI，从而竞争性抑制了EGFR-TKI 与突变区域的结合，减少了EGFR-TKI 对下游信号传导的阻断，产生EGFR-TKI 的获得性耐药[3].但关于T790M 基因突变还有另一种说法是选择性模式，即T790M 突变耐药克隆原本就存在肿瘤组织中，经EGFR-TKI 的筛选治疗后敏感的克隆被杀灭，而含有T790M 突变的耐药克隆部分得以存活下来，使肿瘤整体上呈现耐药性[4].

2.2 C-Met基因扩增

约有5%-20%的获得性耐药是由c-Met基因扩增造成的[5].c-Met基因扩增会使肺癌细胞绕开EGFR 这一靶点，通过增多的C-Met 蛋白跨膜受体与ErbB3 的结合，使下游的P13K/AKT 信号通路增强，促进肿瘤细胞增殖、浸润和转移，同时抑制自噬，从而降低对EGFR-TKI 的敏感性.

2.3 表型转变

Sequist 等人发现有14%原本对EGFR-TKI 反应良好的NSCLC 晚期患者发生耐药是由于转化为了小细胞肺癌SCLC[6].而40%耐药病人会出现上皮细胞化生为间质细胞，即上皮细胞间质化（epithelial mesenchymal transition，EMT），从而形成肿瘤干细胞，降低了EGFR 信号的依赖性.然而，NSCLC 患者对EGFR-TKI 耐药，不仅是因为获得性耐药，还有一部分是自始至终就对EGFR-TKI 不敏感，即原发性耐药.一方面，没有对EGFR 基因敏感突变的NSCLC 患者对EGFR-TKI 天然不敏感；另一方面，即使对EGFR 敏感突变的患者，仍有20%-30%的患者对EGFR-TKI 原发性耐药，如EGFR 基因20 外显子和18外显子的突变、BIM多态性缺失、K-ras 基因突变、EML4-ALK 融合基因突变、PTEN 抑癌基因缺失等.

EGFR-TKI的获得性耐药机制除了有以上的T790M基因二次突变、C-Met基因扩增和细胞表型从非细胞细胞肺癌转化为小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）[7].相对少见的机制还有HER2 扩增[8]、胰岛素样生长因子-1 受体、BRAF 突变和MAK 扩增.

3 TKI耐药后的应对策略

由于EGFR-TKI 耐药的机制很多，目前针对EGFR-TKI 耐药还没有一个标准的治疗方案.T790M 突变是EGFR-TKI 最常见的耐药机制，而突变后肿瘤细胞的增殖仍依赖EGFR 信号传导通路，因此阻断EGFR 信号传导通路是逆转耐药性的重要环节，目前相关的研究有EGFR-TKI 联合EGFR 西妥昔单抗、不可逆的HER-TKI 抑制剂、EGFR-TKI与c-Met 抑制剂联合、T790M 突变特异性抑制剂及热休克蛋白90 抑制剂（CH5164840）.其中针对T790M 突变的特异性抑制剂有雷帕霉素、AP26113、C0-1686、WZ4002 等.目前也有研究表明CH5164840 联合使用厄洛替尼，可以较好的缓解厄洛替尼耐药.针对HGF/MET 信号通路研究药物也是靶向治疗研究的一个热点，根据抑制的传导水平不同，可分为两种：一种是在HGFR 的配体或受体水平阻断该信号通路，代表药有：抗HGF 的单抗（AMG-102 和AV-29 9）和抗HGFR 单抗（Met Mab）[9].另有一种是通过抑制MET 酪氨酸激酶区进而抑制该通路即MET-TKI：Foretinib（XL880）、Tivantinib（ARQ 197）和Cabozantinib（XL184）[10].另外，Xuan Xianglan 等试验证实c-MET 抑制剂（SU11274）联合EGFR-TKI 类药物吉非替尼或厄洛替尼可通过抑制EGFR 信号通路，进而有效抑制EGFR-TKI 耐药的肺癌细胞增殖并促进其凋亡[11].目前c-MET 抑制剂及MET 单克隆抗体如apmatinib（ICN280）联合吉非替尼、Emibetuzumab（LY2875358）[12]联合厄洛替尼的临床试验正在进行中.

4 通过调节肿瘤细胞自噬，可以延缓TKI耐药

自噬在肿瘤的治疗中也是起着双刃剑的作用.一方面，肿瘤细胞由于自我保护反应引起的自噬会促进EGFR-TKI 耐药的形成，近年来研究证实高水平的自噬可以帮助肿瘤细胞在EGFR-TKIs 治疗中存活下来[13]，此时抑制自噬可有效地降低耐药性，增加EGFR-TKI 的细胞毒性作用，提高治疗效果.但另一方面，也有研究表明，在治疗过程中，自噬可介导细胞发生自噬性死亡，这种情况下，可通过诱导自噬，提高EGFR-TKI 治疗效果.由于细胞信号通路网的复杂性，一条通路的抑制会使得细胞另外的通路调节性增强，以及细胞本身突变的多样性，不同患者的癌细胞所处的状态不同以及耐药机制不同，使得促进自噬还是抑制自噬才能起着杀灭癌细胞作用，需要针对个体分别处理.这些研究为治疗辅助药物的研发提供了方向，根据不同情况联合使用自噬诱导剂或抑制剂调节自噬水平，是一个很有希望克服EGFR-TKI 耐药，提高治疗效果的新型治疗方案.

4.1 联合使用自噬诱导剂

联合使用自噬诱导剂，通过诱导细胞发生自噬性死亡，从而来提高EGFR-TKI 的治疗效果.基于P53 基因多态性与NSCLC 患者的耐药性形成的研究，Yaara Gorzalczany 等发现EGFR-TKI 类药物厄洛替尼联合使用自噬诱导剂雷帕霉素可利于提高NSCLC 患者对EGFR-TKI 的反应[14].Eun Ju Kim 等也发现mTOR 抑制剂（依维莫司everolimus/RAD001和雷帕霉素rapamycin）通过诱导自噬，使得PTEN 缺失的非小细胞肺癌细胞重获对靶向治疗药EGFR-TKI 和放射治疗的敏感[15].最近Kenneth K.W.To 等的研究表明PPARγ 激动剂可通过诱导ATG5 基因沉默的PTEN 缺失细胞的自噬性细胞死亡，进而有助于减缓耐药性.因此，PPARγ 激动剂（罗格列酮rosiglitazone、吡格列酮pioglitazone、替米沙坦telmisartan）和EGFR-TKIs 联合使用可作为一种新型的治疗手段，用以规避由于PTEN 缺失产生的EGFR-TKI 耐药[16].

然而Yongjie Wei 等认为目前有关用自噬诱导剂拮抗EGFR-TKI 耐药性的实验有一定的局限性，缺乏说服力，因为他们实验用的是EGFR 高表达细胞株，而不是对EGFR-TKI 敏感的EGFR 突变细胞，由于需要足够多的药量才可诱导自噬的发生，所以对比临床用药，实验中诱导剂的用量多，这些实验都是基于线粒体活动，只反映了细胞增殖和死亡，而不是说明细胞生存中自噬的作用，还缺乏体内实验的支持[17].

4.2 联合使用自噬抑制剂

与前述通过诱导细胞自噬，抑制EGFR-TKI 耐药相反，Yuan-yuan Li 发现在对Erlotinib 敏感的NSCLC 细胞中自噬水平被诱导，抑制自噬诱导凋亡可以进一步增强对EGFR 突变（外显子19 缺失）的NSCLC 中erlotinib 的敏感性，提示通过抑制自噬以提高细胞对EGFR-TKI 的敏感性，可解决获得性耐药的问题[18].该研究也说明使用自噬诱导剂或抑制剂取决于是否存在EGFR 突变.

来自加州大学的Jasmine G.Lee 和Reen Wu 等研究发现：在使用厄洛替尼的基础上，加用自噬抑制剂—顺铂，可通过靶向下调Atg3 介导的自噬和诱导凋亡来抵抗厄洛替尼的耐药形成[19].除此之外，Zou 等人联合使用另外一种自噬抑制剂氯喹（chloroquine，CQ）或羟氯喹（hydroxychloroquine，HCQ）也可以达到抑制肿瘤生长，加强厄洛替尼的肿瘤细胞杀伤作用.他们进一步的分析发现其凋亡水平明显提高，但细胞周期和EGFR 下游信号通路活性没有明显的改变[20].2017年，Xiangxiang Hu 等声明Akt/mTOR 和Erk 信号通路与二代EGFR-TKI 药阿法替尼（afatinib）引起的自噬有关，联合使用该通路的抑制剂氯喹和3- 甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）可有效阻断自噬，很有希望用于作为EGFR 突变激活肺腺癌个体耐药和提高对afatinib 敏感性的新策略[21].

5 治疗NSCLC的潜在新药或辅助药物

近年来，不断有新的自噬诱导剂被发现，并用于治疗非小细胞肺癌的研究，其中相当一部分的研究靶点是针对肺癌细胞的PI3K/AKT/mTOR 通路.2015年，Ruolin Zhao等认为他们的实验首次证明了桔梗皂苷-D（Platycodin-D）可以通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，激活JNK 和p38 MAPK 信号通路来诱导自噬，并因此推断桔梗皂苷-D可成为非小细胞肺癌的替代治疗药物，但其具体作用机制和抗癌效果还没完全研究清楚[22].在miR-16 mimics 可作为一种自噬诱导剂，增强喜树碱等抗癌药的抗癌效果的基础上，Hui Wang等验证了miR-16 mimics 靶向结合耐药肺癌细胞内高表达的ATG3，激活自噬，抑制了TGF-β1 介导的EMT，减缓NSCLC 中的癌细胞转移[23].另外，Aili Wang等表示姜黄素（Curcumin）也可作为mTOR 的抑制物，可抑制PI3K/mTOR 通路的活性，从而诱导细胞自噬，抑制非小细胞肺癌的发展，但其研究缺乏体内研究和临床效用调查[24].

近年来越来越多的研究发现某些化合物也可作为克服NSCLC 的EGFR-TKI 耐药性的辅助药物.Teng Zhao 等认为藤黄酸（Gambogic acid）可在癌细胞已形成抗凋亡的情况下，促进细胞自噬性死亡，因此可作为非小细胞肺癌患者的一种辅助治疗手段[25].而Hengyi Chen 等研究发现联合使用二甲双胍和伏立诺他可以通过诱导BIM 依赖的凋亡来克服EGFR-TKI 耐药，有待成为一个新的克服EGFR-TKI 耐药的方向[26].此外，Hyungmin Jeong 等通过体外系统筛选实验发现从蔬菜，水果提取的多酚类化合物（包括儿茶酚水合物、咖啡酸、白藜芦醇等）在克服NSCLC 的EGFR-TKI 耐药性方面具有潜在的有效作用，可作为长期EGFR-TKI 治疗肺癌病人的辅助药物[27].其中，Michael Yousef等通过总结目前的体外和体内实验结果，表明白藜芦醇可以抑制癌细胞的增殖，诱导细胞周期阻滞和凋亡，有很好的抗癌作用[28].然而，对于多酚类化合物在非小细胞肺癌的EGFR-TKI 耐药中的治疗作用和拮抗EGFR-TKI耐药的分子机制仍未得到充分研究.

与正常细胞相比，肿瘤细胞主要进行无氧酵解，因此需要消耗的葡萄糖更多，而有研究证明，多重耐药肿瘤细胞会过表达与糖酵解有关的蛋白，更加依赖糖酵解存活.而低氧或葡萄糖缺乏的情况下，自噬会增加.利用这一点，Mingtong Ye 等用实验证明，erlotinib 耐药的肺癌细胞ER1-6 比敏感的肺癌细胞更依赖无氧酵解，提出抑制糖酵解可以克服EGFR-TKI 耐药性，可在AKT 或自噬通路抑制剂的基础上进行氧气或葡萄糖剥夺可能作为新型的抵抗肺癌的EGFR-TKI 获得性耐药性方案的解决方法[29].

6 针对耐药机制开发的新药

最近有研究表明设计一个纳米颗粒的药物输送系统- 多重耐药基因1 抗体修饰的几丁聚糖纳米粒子（mAb MDR1-modified chitosan nanoparticles）来运载吉非替尼抗癌药和自噬抑制剂氯喹，同时通过阻断MDR1 受体，可以达到克服耐药的目的.这种新方法既加强了抗癌药和自噬调节剂的传递，使靶向治疗定位更准确，同时可以抑制多重耐药受体活性，使治疗效果更明显，是个重要的拮抗EGFR-TKI 耐药的辅助策略[30].

通过对分子机制的研究，Yosuke Togashi，MD 等研究发现EGFR 突变的NSCLC细胞会出现较高表达水平的β-Catenin.应用β-Catenin 抑制剂XAV939 可以抑制与EGFR-TKI 耐药形成相关的肿瘤干细胞的特性，增强EGFR-TKIs 在EGFR 突变的NSCLC 细胞系中的敏感性，提示β-Catenin 可能成为携带T790M 突变的NSCLC 新的治疗靶点.

7 总结与展望

综上所述，不同的NSCLC 患者患肺癌的分子机制不尽相同，EGFR-TKI 耐药的机制也有所不同，但均与肿瘤细胞的自噬活动密切相关，因此通过分子检查手段，深入到患者个体的耐药机制，应用相关自噬抑制剂或诱导剂来拮抗EGFR-TKI 的耐药性，才可以提高治疗效果，避免盲目用药.但目前许多关于抗非小细胞肺癌药物的研究，其分子机制还不是很明确，是通过自噬影响肿瘤还是其他机制（例如凋亡），这方面的缺陷就还需研究者去填补，并建立有关数据库，及时收录和更新目前NSCLC 的药物研究和新致癌基因、新通路数据，为研究者提供新的思路.临床上，由于细胞信号通路的复杂性，抑制了肿瘤的某些信号通路，另一些通路却代偿性上调.因此，抑制信号通路的靶向治疗应该是多靶点联合用药，效果可能会更好.尤其是长期用药患者，联合用药可降低耐药性.但耐药后的治疗目前仍没有标准的治疗方案，对各种不同耐药机制的病人实现个体化治疗将是最有效的治疗手段.