木棉花超氧化物歧化酶分离工艺的研究

张小雪，李青容，刘敏宜，周晓思，李钰怡，谢丽玲

（汕头大学生物系，广东 汕头 515063）

超氧化物歧化酶（简称SOD）是一种广泛存在于生物体内的酸性金属酶，在pH 5.3 ～9.5 的范围内可稳定存在，对pH 不敏感，热稳定性较高，一般在70 ℃以上才会失活[1].根据现有的研究SOD 共有5 种类型，分别为Cu/Zn-SOD，Mn-SOD，Fe-SOD，Ni-SOD，Co-SOD.植物中以前三种存在形式的可能性较大，而对于后两种目前的研究还较为缺乏，只在少数的生物中发现[2].SOD 能够催化超氧阴离子，发生歧化反应，消除其毒性，在很多方面得到广泛的应用.如在化妆品行业，可作为添加剂被皮肤所吸收，具有防止皮肤衰老，抑制老年斑等作用；在临床应用方面，SOD 具有增加机体免疫力，治疗肿瘤和自身免疫症，抑制食物过敏的疗效；在农业上，适量的SOD 能够提高作物的抗逆能力[1，3-4].SOD 的来源广泛，人们可以从各种材料中进行提取，常见的包括动物血、猕猴桃、大蒜等.动物血中提取出来的SOD 可能含有致热因子，易感染病毒和其他难清洁的污染物，对人体的免疫机制和后续的分离提纯造成一定的影响，因此以动物血为原料生产的SOD 受到了很多国家和地区的抵制[2，5-7].目前利用微生物发酵进行SOD 的工业化生产也是研究的热点，但需要花费大量的时间在菌种的培养和优化上，成本较高[8].而以植物为原料进行提取同样也面临着活性较低，原料种类较少的问题[8-9].本研究则通过木棉花这种新型的原料提取SOD，具有成本低，材料来源丰富，安全性高的特点，是理想的生产原料，生产SOD 的工艺将具有广泛的市场价值.

1 材料，仪器与试剂

1.1 材料

采集新鲜的木棉花花瓣，清洗，恒温烘箱60 ℃烘干，制成粉末，200 目过筛，保存备用.

1.2 仪器与设备

FW177 型中草药粉碎机；THZ-D 型恒温烘箱；HD-1 型核酸蛋白检测仪；LGJ-10型真空冷冻干燥仪；pHS-3C 型pH 计；JY92I 型超声波细胞粉碎机；HH-2 型数显恒温水浴锅；UV-2100 型紫外可见分光光度计；TDL-5-A 型低速大容量离心机；BS224S 型电子天平；HL-2 型恒流泵等.

1.3 试剂

磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，浓盐酸，氯仿，无水乙醇，丙酮，质量浓度为85%磷酸；Tris；EDTA-2Na；考马斯亮蓝G-250；牛血清蛋白等.

1.4 试剂的配制

（1）0.05 mol/L，pH7.8 的磷酸盐缓冲液.

（2）氯仿- 乙醇（体积比3:5）混合液.

（3）邻苯三酚法检测SOD 酶活性所需的试剂：

A 液：pH 8.2，0.1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷一盐酸缓冲溶液.称取1.211 4 g Tris 和37.2 mg EDTA-2Na 溶于64.2 mL 0.1 mol/L 盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100 mL；

B 液：4.5 mmol/L 邻苯三酚盐酸溶液.称取邻苯三酚56.7 mg 溶于少量10 mmol/L 盐酸溶液，并定容至100 mL.

（4）考马斯亮蓝法检测蛋白含量所需的试剂：

1 mg/mL 的标准蛋白溶液；

考马斯亮蓝G-250（0.01%）染液.

2 实验方法

2.1 提取工艺

木棉花SOD 的提取工艺如图1 所示.

2.2 单因素实验

2.2.1 料液比对木棉花SOD 酶活力的影响

称取木棉花粉末0.34 g，在超声波功率360 w，超声波处理总时间8 min①利用超声波处理的其他参数设置均为：超声处理时间3s，间隔时间3s，浸提时间9 h 的条件下，探究不同料液比1∶30，1∶40，1∶50，1∶60 g/mL 对木棉花SOD 酶活力的影响.

图1 木棉花SOD 提取纯化工艺流程图

2.2.2 超声波功率对木棉花SOD 酶活力的影响

称取木棉花粉末0.34 g，在料液比1∶60 g/mL，超声波处理总时间8 min，浸提时间9 h 的条件下，探究不同超声波功率180，270，360，450 w对木棉花SOD 酶活力的影响.

2.2.3 超声波处理时间对木棉花SOD 酶活力的影响

称取木棉花粉末0.34 g，在料液比1∶60 g/mL，超声波功率360 w，浸提时间8 h 的条件下，探究不同超声波处理时间4，8，12，16，20 min 对木棉花SOD 酶活力的影响.

2.2.4 浸提时间对木棉花SOD 酶活力的影响

称取木棉花粉末0.34 g，在料液比1∶60 g/mL，超声波功率360 w，超声波处理总时间8 min 的条件下，探究不同浸提时间4，6，8，10 h 对木棉花SOD 酶活力的影响.

2.2.5 正交实验

根据单因素获得的结果，选取适当的因素水平，对超声波提取木棉花SOD 的条件进行正交实验优化.

2.3 提取液的分离纯化

2.3.1 热变性法

将提取液置于水浴锅中，60 ℃恒温水浴15 min，加热过程轻轻搅拌.水浴后于4 ℃冰浴30 min，之后设置4 000 r/min、15 min 的参数进行离心、取上清，保存备用[2].

2.3.2 氯仿- 乙醇法

向提取液中加入0.25 倍体积的氯仿- 乙醇（3:5）混合液，搅拌15 min 后，离心（4 000 r/min，15 min），静置分层，取上清，保存备用.

2.3.3 分级沉淀法

（1）直接丙酮沉淀

向提取液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15 min 后，离心（4 000 r/min，15 min），取沉淀，-20 ℃下放置30 min；取出后溶于3 mL 0.05 mol/L pH7.8 磷酸缓冲液，获得粗酶液备用.

（2）丙酮二次沉淀

向提取液中加入0.6 倍的预冷丙酮，离心（4 000 r/min，15 min），留上清备用；取沉淀，-20 ℃下放置30 min，取出后溶于3 mL 0.05 mol/L pH7.8 磷酸缓冲液，此为丙酮一次沉淀后的粗酶液.另外向上述提取的上清中加入1.2 倍的冷丙酮，进行同样的操作步骤，离心，取沉淀，冷冻，加磷酸缓冲液后得丙酮二次沉淀的粗酶液[10].由此可得一次沉淀和二次沉淀后的粗酶液，保存备用.

（3）丙酮等电点沉淀

将提取液用HCl 调节pH 至5.0，加入等体积的丙酮，搅拌均匀，离心（4 000 r/min，15 min），取上清；再调节pH 至4.0，设置同样的参数进行离心，获得SOD 沉淀，-20 ℃下放置30 min；取出后溶于3 mL 0.05 mol/L pH7.8 磷酸缓冲液[7]，获得粗酶液备用.

2.4 葡聚糖凝胶柱层析

2.4.1 Sephadex G-75 的预处理

在室温下，将葡聚糖凝胶干粉浸泡于蒸馏水中24 h，并不断搅拌，以保证凝胶溶胀.

2.4.2 操作步骤

将处理好的Sephadex G-75 湿法装柱，柱床体积42 mL，利用0.05 mol/L pH7.8 磷酸缓冲液进行平衡，待核酸蛋白质紫外检测仪绘出稳定的基线即可上样，控制流速为0.5 mL/min，用同样的缓冲液进行洗脱，检测仪上每绘制一个峰便收取一管样液，尽可能地将SOD 纯化.

2.5 SOD酶活力及蛋白含量的测定

2.5.1 酶活力的测定采用微量邻苯三酚自氧化法[11]和试剂盒法

2.5.2 蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法[1]

（1）蛋白质标准曲线的绘制

测定结果绘制的标准曲线如图2 所示.

（2）样品中蛋白质含量的测定

吸取1 mL 的样品，加入5 mL 的考马斯亮蓝G-250，混合均匀，静置30 min 后测定其吸光值.

图2 蛋白质标准曲线

3 结果与分析

3.1 单因素实验结果

3.1.1 料液比对木棉花SOD 酶活力的影响

结果表明，料液比小于1∶20 g/mL 时，提取液浓稠，无法进行后续实验，因此选择料液比为1∶20 g/mL 及其以上的条件进行实验.根据结果显示，料液比为1∶20 g/mL时木棉花SOD 酶活力最强.随着料液比的增大，木棉花SOD 在强离子的条件下结构发生改变，导致活性逐渐降低[7]，而且料液比过高导致比活力变低，对后续的分离纯化不利[10].因此可选择1∶20，1∶25，1∶30 g/mL 的料液比进行正交实验.

图3 料液比对木棉花SOD 活性的影响

3.1.2 超声波功率对木棉花SOD 酶活力的影响

结果如图4 所示，提取效果较好的超声波功率范围在180～270 w 左右.随着超声波的空化作用的增强，细胞被破坏，大量细胞内物质释放，有利于木棉花SOD 的溶出；而另一方面，超声波功率过大，对SOD 酶结构造成破坏，降低酶活力[7].

3.1.3 超声波处理时间对木棉花SOD 酶活力的影响

不同超声波处理时间的实验结果如图5 所示，在处理总时间8 min 之前，随着处理时间的延长，SOD 总活性逐渐提高，这是因为随着细胞破碎越彻底，更有利于SOD 的溶出[7].在8 min 之后，随着时间的延长，木棉花SOD 酶活力无明显变化，说明木棉花SOD 在8 min 时已经充分释放.最终选择7 min，8 min，9 min 三个水平做进一步的正交实验.

图4 超声波功率对木棉花SOD 活性的影响

图5 超声时间对木棉花SOD 活性的影响

3.1.4 浸提时间对木棉花SOD 酶活力的影响

结果如图6 所示，不同浸提时间对实验结果的影响.在浸提时间6 h 之前，随着浸提时间的延长，SOD 总活性逐渐提高，SOD 溶出越充分；在6 h～8 h 之间，溶液中SOD的总活性保持不变；在8 h 之后，随着时间的延长，SOD 活性逐渐下降.因此选择6，7，8 h 三个水平做进一步的正交实验.

图6 浸提时间对木棉花SOD 活性的影响

3.2 正交实验

3.2.1 正交实验的因素水平

在单因素实验的基础上，设计L9（43）的正交实验.具体的设计情况如表1 所示.

表1 正交实验设计

3.2.1 正交实验结果分析

根据单因素实验的结果，对超声波提取的条件进行正交实验，其结果如表2 所示.根据极差大小的比较可知，对于超声波提取木棉花SOD 影响因素从大到小依次是：浸提时间＞超声功率＞超声时间＞料液比.而根据表中均值大小可得出超声波提取木棉花SOD 的最佳条件为A3B1C3D3，从方差分析（表3）的结果可知，由于各因素对木棉花SOD总活性的影响都不显著，不必再进行各因素之间的多重比较.因此，料液比为1∶30，超声波功率为180 w，超声时间9 min，浸提时间8 h 的超声波提取效果最理想.

表2 正交实验的极差分析结果

表3 F检验分析结果

3.3 两种提纯方法结合的探究

超声波提取木棉花SOD 后，为了尽可能地除去杂蛋白获得纯化的SOD，目前大多采用两种方法进行纯化，例如通过热变性结合丙酮沉淀法，或氯仿- 乙醇法结合丙酮沉淀法[1-2，12].由于本研究材料为木棉花其蛋白质含量少，通过二种不同的方法处理之后，虽然除去了一定量的杂蛋白，但是SOD 的活性损失更大，导致最终纯化倍数小于1，因此两种提纯方法结合，不适合用于木棉花SOD 的纯化，结果如表4.

表4 两种提纯方法结合的结果

3.4 SOD提纯方法的筛选

根据实验材料的情况，探究出针对该材料最合适的纯化条件.本研究结果如表5，表明利用热变性，氯仿-乙醇，丙酮沉淀三种方法均能够有效地纯化SOD，去除一定量的杂蛋白.热变性法相较于其他两种方法而言，酶活性回收率高，但是处理过后的粗酶液中仍然含有较多的杂蛋白.氯仿-乙醇法进行提纯，因氯仿毒性强，后续还需要透析处理，步骤较为繁琐[2].而丙酮沉淀法蛋白去除率高，其毒性也较小，是较为理想的提纯方法.因此，在后续提纯SOD 时采用丙酮沉淀法并进行条件优化.

表5 SOD提纯方法的处理结果

3.5 丙酮沉淀条件的优化

丙酮沉淀法对SOD 进行纯化.首先优化纯化条件，选择合适的处理方法如表6.由于丙酮是有机溶剂，会导致蛋白质变性，处理时间一般为15 min.根据表6 表明（三种沉淀方法的实验操作见2.3.3），丙酮等电点沉淀的结果最优，纯化倍数达5.79，所以采用丙酮等电点沉淀进行纯化是最合适的方案.

表6 丙酮沉淀条件优化的结果

3.6 确定最佳纯化条件

经上述探究，确定木棉花SOD 的提取纯化方案为：超声波处理，丙酮等电点沉淀除去杂蛋白，经SephadexG-75（洗脱曲线如图7 所示）进行纯化后，真空冷冻干燥获得成品，结果如表7 所示，纯化倍数可达18.46，因此该工艺流程能够有效地将木棉花SOD 提纯出来.

表7 最终提纯方案的结果

图7 葡聚糖凝胶层析的洗脱曲线

4 总结和展望

SOD 通过清除自由基在食品，化妆品，农业等方面具有广泛的应用，市场前景广阔，但能从植物中提取SOD 的原材料较少，主要包括紫草，绿豆，大蒜等.有关木棉花SOD 提取工艺的研究报道极少，因此本项目利用木棉花为原料能够为植物SOD 的提取开拓新途径[13].根据相关文献报导，木棉花SOD 的活性较高，是较为理想的提取原料[14].本项目通过正交实验确定超声波提取木棉花SOD 的最佳条件为料液比1∶30 g/mL，功率180 w，总处理时间9 min，浸提时间8 h.在提纯SOD 方面，目前采用的方法主要有：热变性法，氯仿-乙醇法，丙酮分级沉淀法.根据实验结果可知，在具体提纯过程中，需要根据实验材料的情况，选择合适的纯化方法，或者将这几种方法有效地结合起来，探究出针对该材料最合适的纯化条件.目前大多数的研究是通过二种方法结合起来充分除去杂蛋白[2，15]，而对于蛋白质含量较少的植物样品，如本研究的木棉花花瓣，选用丙酮等电点沉淀进行除杂，纯化效果好，提取条件温和，适用于大规模生产.本研究致力于开发利用廉价材料生产SOD，提纯条件的优化将对进一步规模生产木棉花SOD提供理论依据.