Met基因在黏虫生殖中的功能分析

刘娟娟 李平 江幸福 程云霞 张蕾

摘要 ：保幼激素（juvenile hormone， JH）是由咽侧体分泌的倍半萜类化合物，可以调控昆虫的很多生理过程，如发育、变态、生殖等。作为bHLH PAS（helix loop helix Per ARNT Sim）转录因子家族成员之一的methoprene tolerant （Met）是JH的受体，在JH的信号传导过程中有非常重要的作用。本研究通过实时荧光定量PCR结合RNAi技术测定了沉默Met基因后黏虫Mythimna separata的Vg基因表达、卵巢发育和生殖行为，旨在探究Met基因在黏虫生殖过程中的功能。结果表明当Met基因沉默后，与卵巢发育密切相关的卵黄原蛋白（vitellogenin， Vg）基因表达量下调了50%，从而显著抑制了卵巢发育，并导致产卵显著延迟、产卵历期显著缩短，产卵量显著下降。结果表明Met基因是黏虫生殖发育过程中的关键受体基因，它通过调节后续Vg的表达和沉积，来达到控制卵巢发育，从而调控生殖作用。

关键词 ：黏虫; 保幼激素; Met; 卵黄原蛋白; 生殖

中图分类号：

Q965

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019113

Function of methoprene tolerant genes in the reproduction of Mythimna separata

LIU Juanjuan1， LI Ping2， JIANG Xingfu1， CHENG Yunxia1， ZHANG Lei1

（1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection， Chinese Academy of

Agricultural Sciences， Beijing 100193， China; 2. Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract

Juvenile hormone （JH） is a sesquiterpene compound secreted by the corpus allatum and can regulate many physiological processes of insects， such as development， metamorphosis， reproduction， etc. Methoprene tolerant （Met）， belonging to the family of the basic helix loop helix Per ARNT Sim （bHLH PAS）transcription factors， is most likely the receptor of juvenile hormone （JH） and plays a crucial role in JH signaling pathway. In this study， we used qPCR combined with RNAi to determine the expression of Vg gene， ovarian development and reproductive behavior in M.separata after silencing Met gene， aiming to explore the functions of Met in the reproduction of M.separata. The results showed that， when Met gene was silenced， the expression of Vg gene， which is closely related to ovarian development， was down regulated by 50%， leading to the significant inhibition of ovarian development， the delay of oviposition and the decrease of oviposition period and egg production. The results indicated that the Met gene is a key receptor gene in the process of reproductive development of M.separata. It regulates the expression and deposition of Vg to control ovarian development and regulate reproduction in M.separata.

Key words

Mythimna separata; juvenile hormone; methoprene tolerant; vitellogenin; reproduction

生殖是昆蟲在生态系统中维持种群繁衍的基本特性[1]。保幼激素（juvenile hormone， JH）是由昆虫的咽侧体分泌的倍半萜类化合物，参与调控昆虫生长、发育、变态、滞育和繁殖等多个过程。在雌性成虫中JH通过控制卵黄原蛋白的合成和摄取来调控昆虫的生殖行为[2]。研究发现棉铃象甲Anthonomus grandis、德国小蠊Blattella germanica、赤拟谷盗Tribolium castaneum咽侧体分泌的JH通常诱导卵黄原蛋白（vitellogenin，Vg）在脂肪体中合成，分泌到血淋巴中，进而被卵母细胞吸收[35]。此外，对蟑螂和蝗虫外源点滴保幼激素类似物后，可以诱导卵黄原蛋白在脂肪体内大量合成[69]。

研究表明，JH需要通过受体才能发挥作用。前期对许多昆虫的JH信号传导的分子机制研究表明作为bHLH PAS转录因子家族成员之一的Met（methoprene tolerant）最有可能为JH的受体。RNAi干扰赤拟谷盗Met基因后，出现了早熟蛹[10]。Met与JH共同调节着昆虫的生殖、卵巢的发育和Vg的合成。双翅目果蝇Met突变体[1112]以及RNAi干扰Met基因后的埃及伊蚊[1314]都表现出卵巢发育迟缓和生殖力下降。在太平洋硕蠊Diploptera punctata和臭虫Cimex lectularius中，Met基因被沉默后显著降低了Vg信使RNA （mRNA）的表达[1516]。在直翅目东亚飞蝗 Locusta migratoria中已经证实JH通过Met基因控制卵黄发生和卵母细胞成熟[17]。

黏虫Mythimna separata是一种典型远距离迁飞害虫，寄主植物达100多种，是严重威胁我国玉米、小麦和水稻三大主粮生产的重大害虫。新中国成立后黏虫多次暴发成灾并造成了巨大经济损失，严重威胁我国农业经济的发展[18]。前期研究发现，JH调控贯穿在黏虫迁飞和生殖的过程中。黏虫在性成熟前开始迁飞，经过长距离迁飞后迁入种群的JH和卵巢发育级别均高于迁出种群[1920]。羽化后1日龄飞行显著提升咽侧体（corpus allatum，CA）的活性，加速飞行肌降解[21]。1日龄点滴JH类似物（juvenile hormone analogue， JHA）使产卵提前，飞行能力下降;1日龄是JH作用的关键时期[22]。此外，羽化后1日龄黏虫Met基因的表达量显著高于其他日龄，且黏虫飞行2个夜晚后卵巢内Met表达量显著提高[23]。因此明确JH在黏虫生殖过程中的信号传导途径，可以提高黏虫的预测预报和防控水平。在本研究中，利用RNA干扰技术，抑制Met基因的表达，从而明确了Met在黏虫生殖过程中的功能。

1 材料方法

1.1 试验材料

供试昆虫：野外采集黏虫成虫在实验室繁殖1、2代后的成虫供试。幼虫采用约40 cm高的玉米叶饲养，饲养密度为10头/瓶，温度为24℃，光周期为L∥D=14 h∥10 h，相对湿度为70%左右[24]。

主要仪器和试剂：荧光定量7500 Real time PCR（ABI公司，美国）;微量注射仪（WPI公司，美国）。TRIzol试剂（Invitrogen公司，美国）;反转录试剂盒FastQuant RT Kit（with gDNase）（天根生物科技有限公司，北京）;实时荧光定量试剂盒SuperReal PreMix Plus（SYBRGreen）（天根生物科技有限公司，北京）;普通引物合成（生工生物工程股份有限公司，上海）;Taq Master Mix（Dye Plus）（诺唯赞生物科技有限公司，南京）;基因干扰引物（锐博生物科技有限公司，广州）。

1.2 试验方法

RNAi引物设计与合成：利用NCBI及黏虫转录组数据库查找出Met基因（登录号：MH050927.1）序列，由锐博生物有限公司（广州）公司设计并合成3条Met基因的siRNA片段及1条与黏虫任何基因的转录本都不同源的阴性对照（NC）siRNA片段（表1）。

RNAi引物筛选：注射日龄为初羽化1日龄，注射浓度为0.1 nmol/μL，体积为2 μL，注射部位为雌蛾腹部第5～6节间膜，取样时间为注射后24、48、72 h。共设置5组处理，每组处理设置3个重复。其中以注射相同体积的无RNA酶水为空白对照，以NC为阴性对照0.1 nmol/μL，以siRNA 1、siRNA 2、siRNA 3为Met基因RNA干扰处理组。注射后解剖卵巢取样，采用实时荧光定量PCR方法检测对Met基因的干扰效果，沉默效率=（1-基因沉默后组织中Met基因的表达量/清水对照组织中Met基因的表达量）×100%。筛选出沉默效率最高的siRNA片段及注射后时间。

Met基因的功能验证：根据以上引物筛选结果，选取抑制效果最佳的Met基因的siRNA片段，选择初羽化1日龄雌蛾进行注射，以注射siRNA的黏虫为处理，注射浓度为0.1 nmol/μL，体积为2 μL;以注射相同浓度和体积NC的黏虫作为阴性对照;以注射相同体积的无RNA酶水作为对照;采用实时荧光定量PCR方法测定RNA干扰48 h后Vg基因的相对表达量，研究Met基因表达被抑制后卵巢发育情况;此外，注射后立即与雄蛾一比一配对，每日饲喂5%新鲜蜂蜜水直至成蟲死亡，记录产卵前期、总产卵量、产卵历期、交配次数等参数。

1.2.1 总RNA的提取及cDNA的合成

取处理后雌蛾的卵巢3对放入无RNA酶离心管中，利用TRIzol方法提取总RNA。用无RNA酶水溶解后，用NanoDrop分光光度计测定核酸浓度以及OD260/OD280。参照Transcriptor First Strand cDNA Synthesis试剂盒（天根生物科技有限公司，北京）合成cDNA。

1.2.2 实时荧光定量PCR反应

从黏虫转录组数据库及NCBI GenBank数据库获得黏虫Vg基因（登录号：KF501044.1）和Met基因序列，由上海生物工程股份有限公司设计并筛选出比较合理的引物Met qF/Met qR、Vg qF/Vg qR，用于qPCR试验。内参基因选择黏虫β actin基因[2526]（登录号：GQ856238.1）。

本试验采用的方法是SYBR Green法。每个处理有3个生物学重复及3个技术重复。荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性15 min后进行40个循环，循环条件包括95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸32 s;Met基因的反应体系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，上下游引物各0.6 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA模板2 μL，加RNAase free ddH2O补齐至20 μL。Vg基因的反应体系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，上下游引物各0.8 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA模板2 μL，加RNAase free ddH2O补齐至20 μL。

1.2.3 数据处理与分析

使用SPSS 20.0软件进行数据统计分析。试验得到的参数均由均值±标准误表示。通过2-△△Ct法对黏虫Met和Vg基因定量测定数据中的Ct值进行处理分析。所有数据均采用单因素方差分析（one way ANOVA），平均数多重比较使用Tukeys HSD法，差异显著性检验水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 siRNA片段的筛选

从Met基因荧光定量的结果（图1）可以看出：3个处理时间的结果中阴性对照与清水对照没有显著性的差异;注射后24 h，siRNA 1、siRNA 2、siRNA 3 3条片段均无显著的沉默效果（F4，40=3.719， P=0063），片段siRNA 2沉默效率最高，为64%;注射后48 h，片段siRNA 2有显著的沉默效果（F4，40=6.257， P<0.05），其中片段siRNA 2的沉默效率可达80%以上;注射后72 h，片段siRNA 2仍有显著的沉默效果但沉默效率下降（F4，40=12.253， P<0.05），其中片段siRNA 2的沉默效率降为58%。因此，片段siRNA 2对Met基因的沉默效率最高，并且处理后48 h沉默效果最佳。

2.2 Met基因干扰后对Vg基因表达量以及卵巢发育的影响

通过以上siRNA片段的筛选结果，采用片段siRNA 2干扰Met基因48 h后，Vg基因的表达量显著下调（F2，6=15.402， P=0.004），与清水对照相比下调了约50%;阴性对照与清水对照相比Vg基因的表达量没有显著性变化（图2）。从图3可以看出，干扰Met基因后，卵巢的发育级别与对照相比显著降低（F2，57=10.091， P<0.05）。从图4可以看出，Met基因被干扰48 h后，卵巢的发育显著减缓，卵巢管透明，卵粒还未形成，卵黃尚未沉积，卵巢的发育级别多数为1级;清水对照卵巢的发育级别多数为2级，卵巢管为白色，卵巢管中已形成卵粒。

2.3 Met基因干扰对黏虫生殖和寿命的影响

如图5所示，黏虫成虫的Met基因被沉默后，对黏虫的产卵前期有显著影响（F2，57=4.756， P<005）， 产卵前期与对照相比延长了0.61 d，且差异显著;阴性对照与清水对照相比没有显著性差异。从表3可以看出，干扰成虫的Met基因后，对交配次数（F2，57=1.307， P=0.261）、雌虫寿命（F2，57=2.355， P=0103）均无显著影响;但与清水对照相比，产卵量（F2，57=7.467， P<0.05）显著下降，产卵历期（F2，57=5.880， P<0.05）显著缩短（缩短了0.78 d），交配率下降了27百分点。

3 讨论

在本研究中发现，干扰黏虫的Met基因48 h后，Vg基因的表达量显著下调。有研究显示，鞘翅目赤拟谷盗Met基因被干扰后卵子发生受阻以及Vg的转录水平下调[5]，与本研究结果相符。此外，干扰雌性成虫的Met基因后，显著抑制了黏虫卵巢的发育和生殖。这与大猿叶虫Colaphellus bowringi Baly和褐飞虱Nilaparvata lugens Stl的相关研究相符， 沉默大猿叶虫和褐飞虱的Met基因后都表现出卵巢发育迟缓，且褐飞虱的产卵前期显著延长，产卵量显著下降[2728]。黏虫Met基因表达被抑制后，JH不能与受体结合，JH下游的信号传导受阻，抑制了Vg基因的表达，从而影响雌性个体的生殖和卵巢的发育。保幼激素（JH）的主要功能是促进Vg在雌性成虫脂肪体中的合成，Vg分泌到血淋巴中，被卵母细胞吸收，从而促进卵巢的发育和成熟。正常的卵细胞生长依赖于卵母细胞大量摄取Vg。因此，根据结果推断，在干扰黏虫的Met基因后，JH的信号传导通路受阻，Vg基因的转录受阻，表达量下降。卵母细胞由于不能摄取足够的Vg，其发育和成熟受阻，从而抑制了卵巢的发育以及生殖。对飞蝗的研究发现，RNAi抑制Met基因表达后，不仅阻止了JH诱导Vg的表达、阻断了卵巢发育和脂质沉积，而且影响卵泡上皮细胞的大小以及降低了卵泡细胞的通畅性（卵泡开放），而卵泡细胞之间的细胞间空隙是将Vg转移到卵母细胞所必需的通道[17]。此外，JH会影响DNA复制，RNAi抑制Met表达后，降低了飞蝗脂肪体细胞的倍数性和DNA含量进而影响卵黄的形成和卵母细胞的成熟[2930]。

干扰大猿叶虫Met基因后注射JHA，发现Vg1和Vg2相对表达均显著下降[26]。在黏虫的前期研究中发现羽化后1日龄点滴保幼激素类似物后，可以缩短产卵前期，卵巢的发育进度显著加快[23]。因此，为进一步明确Met为JHA的受体，需要对Met基因干扰48 h后的初羽化黏虫点滴JHA，测定对Vg基因表达量、卵巢发育以及产卵前期、产卵历期的影响。通过点滴JHA的试验结果进一步表明黏虫JH通过受体Met基因促进Vg基因的表达和卵巢的发育，从而进一步证实Met在黏虫生殖过程中的重要作用。通过一系列的结果中推断出JH的受体Met基因在黏虫生殖过程中对于JH的信号传导以及功能的发挥有至关重要的作用。然而，黏虫Met下游对卵黄生成作用以及卵母细胞成熟的分子调控机制仍不清楚。前期研究发现C2H2型锌指转录因子Kr h1 （Kruppel homolog 1）是Met的直接靶标基因[31]。沉默蟑螂的Met基因后不仅使Met mRNA表达量显著下调，也使它下游的靶基因Kr h1的转录水平显著降低[16]。沉默赤拟谷盗Kr h1基因后出现了早熟蛹，这与Met基因和合成JH的甲基转移酶（JHAMT）下调的结果相似[3233]。因此，为了完善黏虫JH下游卵黄发生和卵母细胞成熟的分子调控机制，需要进一步研究Kr h1在黏虫生殖过程中的功能。

本研究發现干扰Met基因的表达后，阻碍了卵巢的发育和Vg基因的表达，抑制了生殖。因此，本研究结果表明JH通过与受体Met结合调控Vg的转录和卵巢的发育，进而影响生殖。本研究证明了Met在黏虫生殖中过程中的重要作用，对从生理和分子层面解析黏虫迁飞致灾的调控机理、提高预测预报和防控水平具有重要意义。

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（責任编辑：田 喆）