龙膏对顺铂所致肾损伤小鼠的影响

1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2.贵州省德江县民族中医院，贵州 德江 565200；3.贵州中医药大学第一附属医院，贵州 贵阳 550002

铂类药物为大部分肿瘤化疗的基石[1]，而顺铂作为临床中最常用的一种，由于经过肾脏代谢[2]，往往出现严重的肾毒性，使得大部分肿瘤病人被迫终止治疗；目前西医针对铂类药物所致肾毒性主要通过充分的水化来预防[3]，由于需要长时间大量液体的输入，使患者生活质量逐渐下降；而中医药在预防铂类药物肾毒性方面具有其独特的手段，且往往能获得佳效。

龙膏[4-5]为我院国医大师刘尚义教授经验方，由鹿角胶、生熟地黄、桑椹等31味药物组成，其主要功效为补肾填精、养心安神，方中鹿胶乃血肉有情之品，其补肾培元为君；生熟地黄活气血，填精益髓，滋水补阴，能退虚热兼润燥，为补肾之圣药；佐以黄柏等宁神益智、交通心肾；砂仁为使，鼓荡脾胃之气，用冰糖者亦有甘温补中、和中缓急之功，诸药同用，共奏补肾填精、养心安神之效。且在前期的临床研究[5]中发现龙膏对铂类药物所致肾损伤的病人具有一定的改善作用。因此本研究希望通过动物实验证明龙膏具有改善顺铂所致肾损伤的作用，初步了解其作用机制，并为临床运用提供更为有利的证据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 采用6～8周龄雄性清洁级BALB/c近交系小鼠40只，各小鼠体重量(18±2)g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2018-004。

1.2 药物与试剂 龙膏由贵州中医药大学第一附属医院药剂科按原方比例制备膏剂，其由鹿角胶、生熟地黄、黄柏、砂仁等药物组成，1 g膏方含原生药材2.73 g，4 ℃冰箱保存备用。顺铂由贵州中医药大学第一附属医院西药房提供，规格为10 mg/瓶，齐鲁制药有限公司，国药准字：H20073652，批号：AA1A8036A。

1.3 实验主要仪器 小鼠血清尿素氮(BUN)定量ELISA检测试剂盒(批号20181125)；小鼠血清肌酐(SCr)定量ELISA检测试剂盒(批号20181125)；小鼠血清胱抑素C(CysC)定量ELISA检测试剂盒(批号20181125)。Nikon-TS100型倒置相差显微镜(美国)；HH-S2型水浴锅(常州普天仪器制造有限公司)；Xiang Yi-L600型离心沉淀机(德国)；莱卡病理切片机(德国)；电子分析天平(北京德赛公司)。

1.4 分组与造模

1.4.1 实验分组 随机将40只小鼠分成5组，每组8只，空白对照组，模型对照组，龙膏高、中、低剂量组，并适应性喂养1周[4]。

1.4.2 建立肾损伤模型 分别给模型对照组，龙膏高、中、低剂量组，每组每只小鼠以顺铂4mg/kg单次腹腔注射制作肾损伤模型[4]，空白对照组不予处理，给药5d(前期实验中发现顺铂给药5天后小鼠出现尿素、肌酐及胱抑素C的升高，且肾小管多灶状萎缩伴部分肾小管代偿肥大，提示肾损伤模型造模成功)。

1.5 实验给药 实验前，将龙膏加适量蒸馏水浓缩配制成浓度分别为0.25 mg/mL、0.5 mg/mL及1 mg/mL的水溶液备用。给药组根据动物药理实验用药折算方法[6]，得出小鼠每日正常给药剂量等于10 mg/kg并设为龙膏中剂量组；设龙膏高剂量组为正常剂量的两倍为20 mg/kg/d；设龙膏低剂量组为正常剂量组的一半为5 mg/kg/d；模型对照组给予0.2 mL/10g/d蒸馏水灌胃；空白组不作任何处理；隔日称体重1次，并根据体重变化调整灌胃剂量[4]。

1.6 观察指标

1.6.1 一般情况 实验过程中观察各组小鼠的精神、活跃度、饮食及毛发情况，同时注意各组小鼠是否有饮食差、腹泻、消瘦及死亡现象。

1.6.2 小鼠体重变化情况 分别称取小鼠造模前体重及小鼠处死前称体重，观察小鼠造模前及用药后各组的体重变化情况[4，7]。

1.6.3 小鼠血清BUN、SCR、胱抑素C的含量 龙膏灌胃2周后，禁食24 h后称体重，摘眼球法取血[4]，用离心管迅速接血，常温静置1 h后，离心，ELISA检测小鼠血清尿素氮、肌酐及胱抑素C的含量。

1.6.4 小鼠肾脏系数及肾脏病理切片 取出双侧肾脏称重并计算肾脏系数；将其中一侧肾固定于4%多聚甲醛中[4]，进行常规石蜡包埋、切片及HE染色，染色成功后于400倍光学显微镜下观察肾小管上皮细胞、集合管上皮细胞及周围炎性细胞浸润情况和形态变化。

2 结果

2.1 一般情况观察 实验开始前各组小鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)，各组小鼠体重相当，实验具有可比性。在整个实验过程中，空白对照组小鼠的精神状态、活跃程度、进食情况及毛发的光泽度均良好，且小鼠体重逐渐增加；模型对照组及龙膏高、中、低组小鼠则出现不同程度的精神萎靡、活跃度下降、进食减少及毛发光泽度减低且逐渐出现消瘦等情况，而模型对照组的症状最为突出，龙膏高、中、低组小鼠状况稍优于模型对照组。随着用药时间的延长，模型对照组小鼠体重逐渐减轻，各龙膏组小鼠症状较前稍得到控制，与同期模型对照组动物相比，活动相对增多，反应相对灵敏，饮食较前增加，但与空白组相比仍有不足。

2.2 小鼠顺铂干预前、处死前体重变化比较 本次实验初始动物总数为40只，每组8只。顺铂干预前各组小鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)。除空白对照组外其余各组小鼠体重均有明显下降，且与空白对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，模型对照组与龙膏干预组对比小鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3 小鼠肾脏系数比较 模型对照组肾脏系数显著上升，与空白对照组比较具有统计学意义(P<0.05)；龙膏各剂量组与模型对照组比较肾脏系数均降低，且差异具有统计学意义(P<0.05)；而各龙膏干预组之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 各组小鼠体重数据比较

注：与空白对照组比较,aP<0.05；与模型对照组比较,bP<0.05。

表2 各组小鼠肾脏系数比较

注：与空白对照组比较，aP<0.05；与模型对照组比较，bP<0.05。

2.4 小鼠血清尿素氮、肌酐、血清胱抑素C含量变化 模型对照组与空白对照组比较，其BUN、SCR和胱抑素C均明显升高，且具有统计学意义(P<0.05)；龙膏各剂量组与空白对照组比较，其BUN、SCR和胱抑素C均有不同程度升高，且具有统计学意义(P<0.05)，龙膏各剂量组与模型对照组比较，其BUN、SCR和胱抑素C均有不同程度下降，且具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组小鼠血清尿素氮、肌酐、血清胱抑素C比较

注：与空白对照组比较，aP<0.05；与模型对照组比较，bP<0.05。

2.5 各组小鼠肾脏HE染色病理切片情况 空白组：肾组织结构正常，肾小管形态正常，且各结构间界限清晰。模型对照组：肾小管出现多灶状萎缩伴部分代偿性肥大，肾小管上皮细胞出现大量颗粒变性，弥漫淋巴细胞和单核细胞浸润，肾小管内可见大量蛋白管型。三组龙膏治疗组：肾小管上皮细胞局灶性颗粒变性，灶状淋巴细胞浸润，可见灶状的肾小管蛋白管型。如图1所示。

3 讨论

顺铂引起肾脏的损害为现代医学所公认[8]，通常表现为尿中出现透明管型，血中尿素氨、肌酐及胱抑素C升高等现象。现代中医认为铂类药物乃外来之邪毒[4]，瘀结于肾中致瘀毒互结，伤肾中阳气，肾阳亏虚以致肾阴阳两虚，先天受损乃真虚，瘀毒于肾乃假实，固可标本同治，补真虚，泻假实。近年的中医学者进行了大量的临床及动物实验研究，运用中医药针对顺铂所致肾损伤在预防和治疗上都取得了巨大进展，其减毒增效的优势日益显著。根据中医理论，各学者从不同方向阐述了其治疗顺铂所致肾损伤的观点如：宋燕等[9]认为，肾为先天，脾胃乃后天，固以温阳利水为法用以治疗顺铂所致肾损伤取得了一定的疗效。杨桂染等[10]则认为顺铂所致肾损伤乃心肾两虚，固其以滋阴安神为法，其效亦可。刘沈林教授[11]认为顺铂所致肾损伤乃脾肾两虚，固其选用健脾养正消癥方，因其健脾益气、补肾涩精、解毒消癥之功效能有效的保护化疗后的肾功能。刘厚颖等[12]也认为补肾乃第一要务。蒋小燕等[13]认为顺铂所致肾损伤除有肾虚外，仍有邪毒瘀内，固其采用益肾排毒的治疗大法。而除了大量复方研究外，单药治疗顺铂所致肾损伤疗效亦显著，如黄芪的益气固肾，现代学者利用它的提取物及其注射液在临床上[14-16]用于顺铂所致肾损伤取得了良好的疗效，现代医学对黄芪做了更为深入的研究，其大量的体外实验[17-18]证明黄芪的益气固肾对顺铂所致肾损伤的保护作用明显。

笔者认为精藏于肾，肾精是构成人体和维持生命活动的基本物质，肾精主生长发育、主生殖、生髓、充脑，化生血液(精血互化)[19],根据“治未病”的理念，固采用“补肾填精，养心安神”为治疗大法的龙膏治疗顺铂所致肾损伤，方中鹿角胶益精血补肾阳以填髓，生熟地黄滋肾阴，佐桑椹以补阴血，佐黄柏交通心肾、宁神益智，佐仙灵脾等补益元阳，寓阳生阴长，谙合善补阴者必于阳中求阴，阴得阳生则生化无穷，佐以刘寄奴等活血化瘀、升阳化津，补而不滞，砂仁为使，鼓荡脾胃之气，使药力通行全身，用冰糖者亦有和中缓急、甘温补中之功，诸药同用，共奏补肾填精、养心安神之效。本方在治疗顺铂所致肾损伤的同时而不影响顺铂的疗效。

顺铂不仅具有肾脏毒性，且可引起消化系统的反应而出现食欲下降、恶心、呕吐等症状，通过上述实验发现龙膏对顺铂所致肾损伤后的小鼠体重改善不明显，可能与该药物无法改善小鼠胃肠道功能有关；肾脏系数作为评价药物性肾损伤的指标之一，有其独特的价值，从上述实验中发现龙膏对各组顺铂所致肾损伤的小鼠模型肾系数都具有一定的降低作用，提示龙膏对顺铂所致肾损伤有改善作用；临床评价肾功能最常用指标为血尿素氮、血肌酐及胱抑素C的含量，这些指标的升高提示肾损伤，而龙膏能降低顺铂所致肾损伤的小鼠体内血尿素氮、血肌酐及胱抑素C的含量，再次提示龙膏对顺铂所致肾损伤有改善作用；顺铂引起肾损伤的主要靶点为肾小管，使得肾小管上皮细胞变性、坏死，其具有一定的可逆性，而从上述实验中可得出龙膏能改善顺铂所引起的肾小管损伤。综上所述，龙膏对小鼠顺铂所致的肾损伤具有一定的改善作用。然而，其具体的分子机制仍有待进一步的深入研究。