藿香正气水调节小鼠肠道菌群失调的作用研究

1.四川省甘孜藏族自治州人民医院消化内科， 四川 康定 62600;2.成都中医药大学附属医院，四川 成都 61105

人肠道菌群数量庞大，正常情况下，肠道菌群和宿主、外界环境建立起一个动态的生态平衡，对人体的健康起着重要作用，任何打破其内外环境的举措都可导致菌群失调，表现为肠道菌群的种类、数量、比例、定位和代谢特征的变化[1]。机体内的菌群生态平衡遭到破坏后可引起二重感染或重叠感染，使机体的生态平衡遭到严重破坏，从而引发腹泻、腹胀等临床症状。临床上菌群失调多见于大剂量使用抗生素和慢性消耗性疾病，部分中药及中成药具有扶植正常菌群生产的作用，可调节菌群失调，从而达到治疗或改善临床症状的作用[2-5]。本院有大量采用藿香正气水治疗菌群失调型腹泻的临床案例，为探讨其作用机制，笔者设计本实验以观察其对菌群失调的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级昆明种小鼠60只，雌雄各半，体重18～22 g。由四川省中医科学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK(川)2013-19，饲养温度18～22℃，相对湿度58%～62%，喂食颗粒标准饲料，自由饮水和摄食，每2天更换1次垫料，正常饲养3d后供试，实验前小鼠饮水、进食正常，状态良好。

1.2 药品与试剂 乳酶生片(批号160408，桂林南药股份有限公司)；盐酸林可霉素针剂(批号160611，天津金耀氨基酸有限公司)；藿香正气水(160607，太极集团有限公司)；Anaero Gen 2.5 litre(英国Oxoid)；琼脂粉、牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏(广东环凯生物科技有限公司)；L-半胱氨酸(上海伯奥生物科技有限公司)；伊红美兰培养基(EMB)、改良MRS培养基、改良MC培养基、EC培养基；其余试剂均为分析纯。

2 试验方法

2.1 盐酸林可霉素诱导小鼠肠道菌群失调模型的建立[6-8]造模前对小鼠禁食不禁水12 h，然后灌胃0.30 g/mL盐酸林可霉素，0.6 mL/次(小鼠每克体重给药7.2 mg)，2次/d，连续5d，造成小鼠菌群失调。正常对照组给予同体积的生理盐水。于末次给药12 h后取小鼠新鲜粪便进行细菌数检测，观察造模情况。与正常对照组比较，若球菌和杆菌数量变化显著，则认为造模成功。

2.2 分组及处理 取造模成功的小鼠50只随机分为藿香正气水高剂量组、藿香正气水中剂量组、藿香正气水低剂量组、乳酶生组和模型组，每组10只，分别给予灌胃 3.0 mL·kg-1、1.5 mL·kg-1、0.75 mL·kg-1的藿香正气水溶液，0.132 mg·g-1乳酶生片，均用生理盐水补足到相同给药体积(0.2 mL/20 g)，2次/d，连续给药7 d。模型对照组、正常对照组小鼠灌胃同体积的生理盐水。于末次给药12 h后取小鼠的新鲜粪便进行细菌数检测。

2.3 粪便的菌群检测[8]于末次给药12 h后通过按压小鼠腹部的方式迫使小鼠排便，收集约1 g的新鲜粪便，置带有玻璃珠的无菌小瓶中，以1∶10(W/V)比例加入无菌生理盐水，震荡均匀，作为第一稀释浓度。然后用生理盐水连续10倍稀释至10-7。选用10-6、10-7两个浓度的供试液，取10 μL均匀涂布于EMB、EC、MRS、MC平板上。EMB、EC于37℃需氧培养24h，MRS、MC厌氧培养48～72h后观察结果。根据菌落特征以及革兰氏染色结果初步鉴定菌种，并统计菌落数。结果以每克粪便中菌落数的对数表示(lgCFU·g-1)。

3 实验结果

3.1 小鼠肠道菌群失调模型建立 小鼠连续给予盐酸林可霉素3 d后，开始出现腹泻、精神萎靡、扎堆等现象，连续给药5 d后，收集小鼠新鲜粪便，检测其细菌变化。由表1可知，模型组小鼠肠球菌、肠杆菌、双歧杆菌、乳酸菌的含量均降低，与正常对照组比较，肠球菌、双歧杆菌含量减低，具有统计学意义(P<0.05)；肠杆菌、乳酸菌含量明显减低，差异具有显著统计学意义(P<0.01)。

表1 小鼠肠道菌群失调模型建立后小鼠粪便的细菌含量变化

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与正常对照组比较，**P<0.01。

3.2 藿香正气水对肠道菌群失调模型小鼠细菌含量的影响 菌群失调模型小鼠通过乳酶生和不同剂量藿香正气水处理后，其肠球菌、肠杆菌、双歧杆菌和乳杆菌含量均显著上升，与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。由表2可知，灌胃盐酸林可霉素可制造稳定的菌群失调小鼠模型，造模成功后，模型组小鼠给予生理盐水治疗，其肠球菌、肠杆菌、双歧杆菌和乳杆菌的含量分别为(7.48±0.35) lgCFU·g-1、(8.27±0.37) lgCFU·g-1、(8.14±0.28) lgCFU·g-1、(7.22±0.27) lgCFU·g-1，与正常对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，尤其是肠杆菌和乳杆菌(P<0.01)。藿香正气水能显著升高肠道菌群失调模型小鼠粪便中肠球菌、肠杆菌、双歧杆菌、乳杆菌的含量。藿香正气水低剂量组(0.75 g/kg)与模型组比较，肠球菌、肠杆菌、双歧杆菌和乳杆菌含量均有所升高，但除乳杆菌外，差异均无统计学意义(P>0.05)。藿香正气水中剂量组(1.5 g/kg)与模型组比较，肠球菌、肠杆菌、双歧杆菌含量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，乳杆菌含量升高最为明显，差异均有显著统计学意义(P<0.01)。藿香正气水高剂量组(3.0 g/kg)与模型组比较，肠球菌、肠杆菌、双歧杆菌和乳杆菌含量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 小鼠粪便标本的菌群检测结果

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与正常对照组比较，**P<0.01。

4 讨论

目前抗菌药物是最常见引起肠道菌群失调的诱因，抗菌药物使用后将肠道内敏感细菌大量杀死，各菌种间的比例发生较大幅度的变化而超出正常范围的状态，特别是原籍菌的数量和密度下降，而外籍菌的数量和密度升高。抗菌药物所致的肠道菌群失调的主要临床症状为腹泻，本实验应用盐酸林可霉素灌胃造模后小鼠新鲜粪便的菌落数量和种类均明显下降，且给药3 d开始出现腹泻症状，随后出现精神萎靡、食欲不振等症状，表明通过此法所制作的肠道菌群失调小鼠模型是可靠的，实验结果可信[9-10]。

多数细菌在同一环境中生存，相互间会形成生物拮抗，避免某一种细菌(特别是致病菌或条件致病菌)成为优势菌，最终对机体产生不良反应，如：呕吐、腹泻等临床症状[7]。藿香正气水主要由藿香、苍术、陈皮、厚朴、白芷、茯苓、半夏、甘草、紫苏等多味中药组成，具有散寒化湿、和中祛暑的作用，常用于治疗脘腹胀痛、呕吐腹泻以及胃肠感冒等。在临床实践中，发现其对肠道菌群失调型腹泻亦具有良好疗效，为发掘其治病机理，遂设计本实验，以期能初步揭示其治疗肠道菌群失调型腹泻的方式以及物质基础。在本实验中，藿香正气水中、高剂量组均能显著改善盐酸林可霉素所致的肠道菌群失调症状，扶植肠道菌群，恢复肠道健康，表明藿香正气水具有一定调节肠道菌群失调的作用。