微小RNA-26a对食管癌Eca109细胞增殖、迁移、凋亡及细胞周期的影响

贺家勇，徐 茜，杨晨晨

(1.中国石油乌鲁木齐石油化工有限公司职工医院外一科，新疆 乌鲁木齐 830019；2.新疆医科大学基础医学院免疫学教研室，新疆 乌鲁木齐 830011；3.新疆医科大学学报编辑部，新疆 乌鲁木齐 830011)

食管癌是人类常见的消化道肿瘤之一，其病理类型分为食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)和食管腺癌(adenocarcinoma，AEC)，其中最常见的是ESCC。在世界范围内，食管癌的发病率和病死率分别居第8位和第6位[1]。我国是食管癌高发国家[2]。寻找食管癌的肿瘤标志物，对于食管癌发病机制的阐明和早期诊断具有一定意义。微小RNA(microRNA，miR)是在动物和植物细胞中发现的一类短链非编码RNA，由18～25个核苷酸组成，第1个miR于1993年在秀丽隐杆线虫中被识别。miR主要在转录后水平调控基因表达，对机体的多种生理和病理生理过程发挥调节作用[3-4]。研究显示，miR表达异常与肿瘤恶性潜能、预后有关[5-6]，调节性miR-26a在肿瘤中具有明显的双重功能，当作为致癌基因时，miR-26a作为磷酸酶的拮抗剂张力蛋白同源物和丝裂原活化蛋白激酶，可促进胶质母细胞瘤的形成[7-8]。相反，miR-26a可阻止正常肝组织从炎症发展为肝细胞癌[9]，通过腺相关病毒递送，减弱细胞周期蛋白(recombinant cyclin，CCN)D2和CCNE2的表达[10]。另外，miR-26a在横纹肌肉瘤和MYC诱导的淋巴瘤中表达下调[11-12]。但在食管癌中，miR-26a的作用尚不清楚。本研究分析了miR-26a对食管鳞状细胞癌Eca109细胞增殖、迁移、细胞周期和凋亡的影响，以探讨miR-26a在食管癌中的生物学作用。

1 材料与方法

1.1细胞来源人食管鳞状细胞癌细胞系Eca109由武汉大学细胞保藏中心惠赠，细胞培养于37 ℃、含体积分数5%CO2的恒温培养箱，采用含青链霉素双抗及体积分数10%胎牛血清(fatal bovine serum，FBS)的RPMI1640培养液培养。

1.2主要试剂与仪器FBS、2.5 g·L-1胰蛋白酶(美国Gibico公司)，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)(美国HyClone公司)，细胞凋亡试剂盒(美国Invitrogen公司)，二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(美国Sigma公司)，RNA酶(北京天根生化科技有限公司)，四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)(南京碧波生物科技有限公司)；电热恒温培养箱(德国Thermo公司)，倒置显微镜(日本Olympus公司)，酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1细胞分组与处理将正常培养的人食管鳞状细胞癌Eca109细胞分为正常对照组、阴性对照组和miR-26a过表达组。正常对照组Eca109细胞正常培养，不加任何类型慢病毒；阴性对照组细胞转染随机序列慢病毒，miR-26a过表达组细胞转染过表达慢病毒miR-26a。

根据慢病毒转染的预实验，得到感染复数(multiplicity of infection，MOI)值为20，根据厂家提供的病毒滴度换算加入病毒的体积。MOI=20时，96、6孔板每孔加病毒量分别为2、40 μL。

1.3.2MTT法检测细胞增殖能力取各组转染细胞，按每孔3×104个细胞接种于96孔板，每组设3个复孔。分别于转染后培养0、24、48、72、96 h时后，每孔加入5 g·L-1MTT溶液20 μL，恒温培养箱中继续培养5 h，弃上清液；每孔加入150 μL DMSO。用酶标仪在490 nm波长下测定各孔吸光度值。

1.3.3流式细胞术检测细胞周期取各组转染细胞，按每孔3×105个细胞接种于6孔板，每组设3个复孔。培养48 h后制备细胞悬液；缓慢滴入 375 μL -20 ℃预冷的无水乙醇，1 000 r·min-1离心 5 min，弃去无水乙醇，用PBS洗2～3遍；加入 500 μL 含50 mg·L-1RNA酶的PBS，37 ℃恒温培养箱内孵育30 min；加入5 μL 1 g·L-1碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液，冰上避光孵育 15 min。用流式细胞仪检测各组细胞的周期分布。

1.3.4流式细胞术检测细胞凋亡取各组转染细胞，按每孔3×105个细胞接种于6孔板中，每组设3个复孔。培养72 h后制备细胞悬液；1 000 r·min-1离心5 min，弃上清液；将细胞沉淀加入1×结合缓冲液100 μL重悬，平均分成3份，加入3个EP管中，1个EP管加入5 μL AnnexinⅤ-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)，1个EP管中加0.4 μL 10 g·L-1PI染色液，另1个EP管加入AnnexinⅤ-FITC和PI，混匀后避光 5 min；每个EP管中加入400 μL 1×binding buffer，用200～400目钢筛过滤，流式细胞术检测细胞凋亡率。

1.3.5细胞划痕实验检测细胞迁移能力取各组转染细胞，按每孔3×105个细胞接种于6孔板，每组设3个复孔。所有细胞正常培养，换液时用 10 μL 无菌枪头在每孔底部距直径0.5 cm的位置平行画2条直线。分别于转染后0、24、48、72 h时拍照，测量划痕宽度，计算划痕愈合率，划痕愈合率=(0 h的宽度-测量时间点的宽度)/0 h时的宽度。

2 结果

2.1miR-26a过表达对食管癌Eca109细胞增殖的影响结果见表1。转染后0、24、48 h，3组细胞增殖能力比较差异无统计学意义(P>0.05)。转染后72、96 h，miR-26a过表达组细胞增殖能力低于正常对照组和阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组与正常对照组细胞增殖能力比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表13组Eca109细胞增殖能力的比较

组别细胞增殖能力(吸光度值)0 h24 h48 h72 h96 h正常对照组0.414±0.0900.765±0.1491.051±0.2761.516±0.0801.466±0.041阴性对照组0.451±0.0280.669±0.0460.909±0.1281.397±0.1211.517±0.081miR-26a过表达组0.463±0.1460.604±0.0580.720±0.0401.068±0.057ab1.179±0.016abF0.8700.2814.25626.61346.688P0.4510.1120.0500.0000.000

注：与正常对照组比较aP<0.05；与阴性对照组组比较bP<0.05。

2.2miR-26a过表达对Eca109细胞周期的影响结果见表2。转染后48 h，miR-26a过表达组G1、G2期细胞所占比例高于正常对照组和阴性对照组，S期细胞所占比例低于正常对照组和阴性对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。阴性对照组与正常对照组G1、S和G2期细胞所占比例比较差异无统计意义(P>0.05)。

表23组Eca109细胞周期分布比较

组别细胞周期G1/%G2/%S/%正常对照组54.30±1.598.13±1.0735.87±1.71阴性对照组55.20±8.89a8.03±0.76a36.76±0.15amiR-26a过表达组62.03±1.29a21.63±13.92a16.33±3.15aF32.365101.81793.226P0.0010.0000.000

注：与miR-26a过表达组比较aP<0.05。

2.3miR-26a过表达对食管癌细胞Eca109凋亡的影响转染后72 h，正常对照组、阴性对照组和miR-26a过表达组细胞凋亡率分别为(2.28±0.24)%、(2.40±0.54)%、(2.31±0.27)%，3组细胞凋亡率比较差异无统计学意义(F=0.101，P>0.05)。

2.4miR-26a过表达对食管癌Eca109细胞迁移能力的影响结果见图1和表3。转染后0、48 h，3组划痕愈合距离无明显差别，划痕宽度相近，划痕愈合率比较差异无统计学意义(P>0.05)。转染后 72 h，正常对照组、阴性对照组划痕两端的细胞已接近靠拢，miR-26a过表达组细胞划痕宽度仍较宽；miR-26a过表达组细胞划痕愈合率低于正常对照组和阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组与正常对照组细胞划痕愈合率比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图1miR-26a过表达对Eca109细胞迁移能力的影响(倒置显微镜，×100)

Fig.1EffectofmiR-26aoverexpressiononthemigrationofEca109cells(invertedmicroscope，×100)

表33组Eca109细胞划痕愈合率比较

组别划痕愈合率0 h48 h72 h正常对照组1.000±0.0000.697±0.0700.487±0.108阴性对照组1.000±0.0000.592±0.0140.878±0.016miR-26a过表达组1.000±0.0000.598±0.2670.192±0.015abF-0.41021.806P-0.6810.002

注：与正常对照组比较aP<0.05；与阴性对照组比较bP<0.05；“-”表示无数据。

3 讨论

有研究显示，miR在肿瘤的发生、细胞增殖和凋亡、肿瘤血管形成、侵袭和转移等方面发挥着重要的作用[13-15]，因此，miR可能作为某些肿瘤新的预测指标和治疗靶点。miR-26a在不同肿瘤中可以扮演抑癌基因和促癌基因的双重角色，但miR-26a在食管癌中的作用尚不明确。

本研究结果显示，转染后72、96 h，miR-26a过表达组细胞吸光度值低于正常对照组和阴性对照组，提示miR-26a过表达能降低食管癌细胞的增殖能力。邓静静[16]将miR-26a特异表达载体稳定转染入胰腺癌细胞株SW-1990和Capan-2，通过细胞计数试剂盒法对细胞增殖能力进行分析显示，miR-26a过表达对胰腺癌细胞的增殖具有抑制作用。本研究结果与其一致，在食管癌细胞中miR-26a过表达使食管癌细胞生长缓慢，miR-26a对食管癌细胞的生长起抑制作用。

赵文淘[17]研究显示，miR-26a可抑制肝癌细胞增殖并促进其迁移，过表达miR-26a后BEL-7402和HepG2细胞体外迁移能力增强。进一步研究发现，miR-26a在癌旁组织中高表达，在肝癌组织中低表达，有转移的肝癌组织中miR-26a的表达较无转移肝癌组织高，提示miR-26a可以促进肝癌细胞迁移及侵袭。本研究结果显示，转染后72 h，正常对照组、阴性对照组划痕两端的细胞已接近靠拢，而miR-26a过表达组细胞划痕宽度仍较宽，提示miR-26a对食管癌细胞的迁移起抑制作用。本研究与赵文淘[17]报道不一致，推测miR-26a在食管癌发生、发展的过程中所起到的作用在不同时期可能是不一样的，这有待于进一步研究证实。

细胞周期是指细胞从一次分裂完成开始，至下一次分裂结束所经历的过程，细胞周期可分为间期与分裂期2个阶段。杨璐西等[18]研究了miR-26a对子宫肌瘤细胞周期和增殖的影响，结果发现，在转染后24 h，与对照组比较，miR-26a高表达的子宫肌瘤细胞G1期所占比例增高。本研究结果显示，miR-26a过表达组细胞转染后48 h，G1期细胞所占比例高于正常对照组和阴性对照组，S期和G2期细胞所占比例低于正常对照组和阴性对照组，与杨璐西等[18]报道的miR-26a在子宫肌瘤细胞周期中的作用特点一致，提示miR-26a可阻断人食管鳞状细胞癌Eca109细胞由G1期向S期的过渡。但正常对照组、阴性对照组和miR-26a过表达组细胞凋亡率比较差异无统计学意义，提示miR-26a对食管癌细胞的凋亡未产生影响，可能与细胞类型有关。

综上所述，miR-26a可以抑制食管鳞状细胞癌Eca109细胞增殖和迁移，阻断细胞由G1期向S期的过渡，但对细胞凋亡未产生明显影响。miR-26a有望成为食管癌的肿瘤标志物，但是本研究仅从细胞水平验证了miR-26a对食管鳞状细胞癌Eca109细胞功能的影响，后续实验可收集食管癌患者临床资料进行组织水平的研究，探讨miR-26a的表达与食管癌患者临床病理学特征及预后的关系，同时可进一步分析miR-26a对食管癌发生、发展的调控作用，为食管癌的治疗及预后判断提供参考依据。