血型嵌合体一例血清学特点及基因学测序分析

孔存权，连利霞，朱伟彦，杨子怡，燕备战

河南省人民医院(郑州大学人民医院)输血科 郑州 450003

嵌合体指其细胞衍生自两个或多个受精卵的个体，遗传学上指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体，免疫学上则指一个机体有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系彼此耐受不排斥的嵌合状态。血型嵌合体是嵌合体的一种，又叫血型开米拉，多发生在异型输血、异卵双生或双精受精以及异型骨髓移植后，其中异型输血或异型骨髓移植后的血型嵌合属于暂时性嵌合，而遗传性嵌合属于永久性嵌合(先天性嵌合)。嵌合体尤其是血型嵌合体的存在往往给临床输血工作带来一些问题，诸如血型鉴定困难、输血困难、亲缘关系疑问等。早期，血型嵌合体的检测局限于血清学方法，表现为混合凝集外观，但很难确诊。分子生物学技术，尤其是PCR体外扩增和DNA测序技术的发展，为血型嵌合体的研究提供了工具。本研究借助一例嵌合体血型患者，回顾分析了血型嵌合体的血清学及基因学特点。

1 材料与方法

1.1标本来源该例为河南省人民医院门诊患者，年龄、疾病不详，无输血史，无移植史。

1.2试剂及仪器单克隆抗A、抗A1、抗B、抗AB、抗H抗体及标准反定型红细胞A细胞(Ac)、B细胞(Bc)和O细胞(Oc)均购于长春博德公司。DNA提取试剂盒购自上海生工生物技术有限公司。血型正反定型卡与抗人球蛋白卡购自戴安娜公司。引物合成及测序由上海生工生物技术有限公司完成。

1.3血清学试验采用试管法与戴安娜血型定型凝胶卡进行ABO正反定型，正定型增加抗A1、抗H以及自身对照，反定型增加Oc。用多特异性抗人球蛋白卡(IgG与C3)检测红细胞上有无不完全抗体，用抗筛细胞检测血清中有无不规则抗体。采用吸收放散技术检测弱B抗原。

1.4基因学定型用血液DNA抽提试剂盒抽提先证者及其父亲、母亲、儿子外周血基因组DNA，分别对ABO基因的外显子1～7进行PCR扩增，引物序列和扩增条件参考文献[1]。PCR体系(25 μL)中包含基因组DNA、引物、混合La酶，反应在美国ABI ProFlex PCR System仪上进行。反应条件为95 ℃3 min，95 ℃30 s、57 ℃30 s、72 ℃60 s，30个循环，最后72 ℃延伸7 min。其中第1外显子GC含量高，需要GC buffer，各成分加入量及反应条件略有变动。取PCR反应产物2 μL用于琼脂糖凝胶电泳，EB染色，获取目的条带后，取10 μL进行测序分析。分别对先证者及其父母ABO 基因的7个外显子及其侧翼序列直接测序。同时将先证者血型基因第7外显子的PCR产物克隆到pMD18-T载体(TaKaRa公司)，在ABI377测序仪上对插入片段进行序列分析。

1.5交叉配血试验基于疑似嵌合体血型和血清学结果，拟用配合性输注(O型洗涤红细胞)，采用凝聚胺结合卡氏法(Liss-coombs卡)进行交叉配血试验。

2 结果

2.1血清学结果先证者红细胞定型：抗A与抗D凝集强度均为4+、抗B抗血清呈混合凝集(±)且抗B测定管(或抗人球蛋白卡)底部有大量红细胞，未检出抗A1，反定型Ac、Bc、Oc均不凝集(表1)。家系调查结果显示其父为B型、RhD+，母为A型、RhD+，儿为O型、RhD+，正反定型均一致。先证者B抗体管内底层经洗涤后的红细胞与B抗体血清不凝集，与A抗体凝集，提示是A型红细胞，说明该患者血里既有A型红细胞又有B型红细胞。先证者直接抗球蛋白试验阴性，不规则抗体筛查试验阴性，吸收放散试验证实存在B抗原。

表1 先证者及家系调查血清学结果

0代表无凝集，+代表凝集强度，±代表混合凝集

2.2基因检测结果先证者第6、7外显子区域显示存在261G/del、297A/G、467C/T、526C/G、646T/A、657G/T、681G/A、703G/A、771C/T、796C、803G/C、829G/A、930G/C等杂合位点(图1)，初步判断可能有3个等位基因：A102、B101和O02。测序结果表明先证者含有A102、B101与O02等3个等位基因。家系调查结果显示其父基因型为B101O02，母为A102O01，子为O01O02，姐为B101O02。

A，B：杂合位点位于血型基因第6外显子；C、D、E、F：杂合位点位于血型基因第7外显子

2.3交叉配血AB型悬浮红细胞配血主、次侧均无溶血、无凝集。A、B、O型悬浮红细胞配血主侧均无溶血、无凝集，次侧均无溶血、有凝集。

3 讨论

先证者表现出两群不同表型的红细胞，应该属于遗传性血型嵌合体。这种在体内存在两种不同遗传学特征细胞群的天然个体极为罕见，通常在两个受精卵合二为一融合时或胞胎之间血管未分开时已经发生。镶嵌现象(发生自单个配子)和嵌合体(发生自两个或多个配子)等[2]也属于这类情况。血型嵌合体还会导致ABO表现型与基因型不相符[3]，如在中国台湾报道过1例血清学表现为AelBel，但其父母基因型却分别为B101型和A102O02型，通过单体型基因学检测证实其为A102O02/B101O02嵌合血型。这里呈现的弱嵌合体血型，推测原因可能是编码低活性的A转移酶遗传或A102O02与B101O02相互影响导致。

自1952年Dunsford等[4]报道了第一例嵌合体血型现象到目前，全球已发现了近百例先天性血型嵌合体。血型嵌合体不仅表现在ABO血型系统，其他血型系统如P、Kidd以及Duffy系统中也可存在。目前的研究[5]表明具有嵌合体血型的人，其红细胞在做ABO血清学检测时常呈现混合外观视野，但常规的玻片法、试管法等鉴定时并不容易发现，具有高灵敏度的微柱凝胶卡法也只能怀疑，嵌合体血型弱抗原也不能通过吸收释放试验与抗原减弱区分开来，确诊还需要借助DNA血型分型技术。嵌合体现象常常会导致ABO血型遗传不符合经典遗传规律[6]。具体到本例先证者，其外表正常，分娩时并无双胞胎、输血史和干细胞移植史，其血清学结果为AB型，但其红细胞凝集不典型(混合视野)，基因定型显示可能含有A102/B101/O02等位基因。家系调查结果显示其父为B型，基因型为B101O02；母为A型，基因型为A102O01；初步怀疑先证者为嵌合体或者亚型。第6、7外显子测序结果表明先证者具有A102/B101/O02共3个等位基因，B101和O02可能来自于其父，而A102来自于其母。先证者的遗传因素导致在3个等位基因存在的情况下，A与B转移酶未能充分发挥作用，血型鉴定时呈现混合凝集外观。先证者未能显示4个等位基因可能是在一个合子中产生的细胞遗传学异常的结果，例如三体型，额外的染色体来自一个亲本。

嵌合体血型应引起重视。一方面嵌合体血型误诊能引起严重的输血反应[7]。有1例61岁患者因移植术后高血压症、Hct降低，输入280 mL的O型红细胞(与此献血者为双胞胎，血液中含少量B抗原)几小时后发生严重溶血。另一方面血型嵌合体免疫耐受的研究对基因干细胞移植和骨髓移植有着深远的影响。已经有越来越多的研究[8]表明异基因干细胞移植以及骨髓移植之后形成的微嵌合状态，对受体和移植物均有影响，并且可能有利于宿主对移植物的免疫耐受，能够在一定程度上反映移植物的状态。目前通过适当方法检测受者体内嵌合体的分布及数量变化可用于评估及预测移植后的排斥反应、移植物抗宿主反应以及一些自身免疫性疾病。