Hep G2细胞外泌体冲击树突状细胞介导的抗肿瘤作用

章 菊，叶书来，张昌龙，周 倩

（中国科技大学附属第一医院/安徽省立医院检验科，安徽 合肥 230001）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在中国是一种常见的恶性肿瘤，其发病率和致死率均较高，而目前HCC的治疗处于瓶颈阶段，对于早期HCC患者，手术切除是最有效的治疗方法，然而，大多数HCC患者被诊断时已为中晚期，治疗效果差，生存期短。免疫治疗是一种非常有前途的治疗策略，在肝癌中的研究也取得了一定的进展[1-2]。

最近外泌体（exosomes）的发现及其多效生物活性引起了研究者们广泛关注，目前被广泛用于疾病诊断和作为药物输送车的研究。近年来，也有大量研究表明肿瘤细胞来源的外泌体有刺激树突状细胞（dendritic cells，DCs）成熟的效应[3]。但是也有研究表明，来自肿瘤的外泌体有抑制骨髓DCs分化的效应[4]。两种研究结果的不一致性可能是由于外泌体的来源和所处环境不同导致所发挥的作用不同。本研究将来源于HCC细胞的外泌体与DCs共孵育，发现DCs表面分子上调，DCs诱导T淋巴细胞增殖并介导肝癌细胞的特异性杀伤效应，此外DCs诱导T淋巴细胞对肺癌细胞A549有一定的杀伤作用。提示HCC细胞的外泌体可能是以DCs为基础的肝癌或其他肿瘤免疫治疗潜在的抗原谱。

1 材料与方法

1.1 细胞系及主要试剂

人肝癌细胞系HepG2和人肺癌细胞A549购自中国科学院细胞库，培养在高糖DMEM培养基，含10%胎牛血清，100 U/mL青-链霉素，于37℃、CO2体积分数为5%的培养箱内培养。DCs来源于人外周血单核细胞，培养于1640培养基，含10%胎牛血清和终浓度为50 ng/mL的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor，rhGM-CSF）、白介素 4（recombinant human interleukin，rhIL-4）。高糖DMEM、RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自澳大利亚Clark公司，rhGM-CSF和rhIL-4购自PeproTech，淋巴细胞分离液Ficoll和单个核细胞分离液Percoll购自美国GE公司，抗体FITC-anti-CD86、PE-anti-CD80、PE-anti-CD83购自美国BD 公 司 ， 抗 体 CD63、 CD81、 Calnexin、 HSP70、HSP90 和 甲 胎 蛋 白 （α-fetoprotein， AFP）购 自 Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 外泌体提取 收集HepG2细胞上清于50 mL贝克曼离心管中，3 000 g离心15 min，除去细胞碎片，转移上清液于另一离心管，1×104g离心30 min，收集上清液并用0.22μm过滤头过滤，将滤液置新的50 mL专用贝克曼超速离心管，1×105g离心1 h，小心弃去上清，收集管底部的沉淀颗粒，用大量PBS重悬这些小颗粒，1×105g重复离心1 h。BCA法蛋白定量后-80℃保存备用。

1.2.2 透射电子显微镜观察外泌体形态 用PBS溶解蛋白制备外泌体悬浮液，将20μL外泌体在室温下置于铜网格上1～2 min，滤纸轻轻吸去周围过多的液体，室温下用12%磷钨酸负染色1～2 min，室温下用2%戊二醛固定5 min。随后用PBS洗涤该网格3次，每次3 min，白炽灯下晾干，于透射电子显微镜下观察外泌体形态。

1.2.3 Western blot检测外泌体蛋白 将外泌体直接加入蛋白裂解液RIPA，含1 nmol/L的苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride， PMSF）冰 上 裂 解 10 min，经BCA法蛋白定量后，取20μg加入上样缓冲液，100℃沸水中煮10 min。经SDS-PAGE电泳分离、转PVDF膜、封闭，分别加入1∶500稀释的CD63、CD81、HSP70、HSP90和AFP相应的一抗，4℃过夜，经二抗孵育显影后曝光。

1.2.4 DCs的诱导 取健康志愿者外周血200 mL经Ficoll和Percoll密度梯度离心分离后得到外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），将细胞培养于含有10%FBS、终浓度为50 ng rhGM-CSF和rhIL-4的1640培养基，37℃、CO2体积分数为5%的培养箱内培养，第3天半量换液，第5天全量换液。第6天加入外泌体，继续培养48 h后收集细胞。

1.2.5 外泌体冲击DCs对T淋巴细胞增殖的影响 健康志愿者外周血经Ficoll分离得到PBMC，经磁珠分离得到T淋巴细胞，将5μmol/L荧光染料羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（carboxynuorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE）标记的淋巴细胞与各组DCs以5∶1比例共培养5 d。实验分3组即空白淋巴细胞组、未成熟DCs与淋巴细胞共培养组、外泌体冲击后DCs与淋巴细胞共培养组。流式细胞术检测各组细胞增殖，收集CFSE阳性细胞，左侧区域为CFSE荧光强度逐渐减弱的增殖淋巴细胞。

1.2.6 Annexin-V/PI双染法检测外泌体冲击DCs诱导细胞毒性T淋巴细胞对肿瘤细胞杀伤效应 将HepG2和A549作为靶细胞，T淋巴细胞为效应细胞，分别按效∶靶细胞25∶1混合，共孵育24 h。实验分为4组即HepG2细胞组、未成熟DCs与细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）共培养后+HepG2细胞组、外泌体冲击后DCs与CTL共培后+HepG2细胞组、外泌体冲击后DCs与T淋巴细胞共培后+A549组。流式细胞术检测细胞凋亡，在流式细胞仪的散点图上，Annexin-V阳性细胞群为凋亡细胞群。

1.3 统计学分析

采用Prism 6.0软件进行统计分析，数据以xˉ±s表示，两组比较采用t检验，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 电镜下肝癌Hep G2细胞来源的外泌体结构

来源于肝癌细胞株HepG2的外泌体，经透射电镜捕获到一组直径30～120 nm的小杯状圆形囊泡，散在或成团分布，见图1。

图1 电镜下肝癌细胞HepG2来源的外泌体结构（×150 000）

2.2 Western blot检测外泌体中蛋白表达情况

外泌体标志性蛋白CD63、CD81及热休克蛋白HSP70、HSP90和肝癌抗原AFP均有表达，细胞蛋白Calnexin在HepG2中检测到表达，在外泌体中未检测到表达，提示该小囊泡为真正的外泌体（见图2）。

图2 HepG2细胞及其外泌体中相关蛋白的表达

2.3 外泌体冲击DC的形态和表型

外周血来源的单核细胞经rhIL-4和rhGM-CSF诱导分化成未成熟DCs（图3A）；外泌体与DCs共培养48 h后可见大部分细胞体积增大，悬浮生长，细胞边缘有树突样突起，DCs朝向成熟分化（图3B）。经流式细胞术分析发现，DCs表面分子CD80、CD83、CD86的表达明显上调（图4）。

图3 未成熟DCs和成熟DCs（×40）

图4 DCs表面分子表达

2.4 外泌体冲击DCs对T淋巴细胞增殖的影响

外泌体与DCs共培养组诱导初始T细胞增殖显著高于未成熟DCs组以及T淋巴细胞空白组（P均＜0.01）。见图5。

图5 肝癌细胞株HepG2外泌体冲击DCs对T淋巴细胞增殖的影响

2.5 外泌体冲击DCs诱导CTL体外肿瘤杀伤效应

结果显示，与HepG2细胞和未成熟DCs与T淋巴细胞共培养组比较，外泌体冲击DCs诱导CTL对肝癌细胞有明显的杀伤作用（P＜0.01）。且对其他肿瘤细胞如肺癌细胞A549也有明显的杀伤效应（P＜0.01），见图6。

图6 外泌体冲击DCs诱导CTL体外特异性和非特异性的杀伤肿瘤效应

3 讨论

由于肝脏独特的免疫耐受性，HCC的治疗干预面临着挑战。基于DCs的免疫治疗在人类试验中显示出良好的前景[5]，抗原来源的选择对DCs介导的免疫疗法至关重要。肿瘤细胞裂解物曾经作为抗原，是激活基于DC的免疫治疗有吸引力的策略，但在肝癌患者中的反应率相对较低[6]，肿瘤来源的外泌体携带广谱抗原可以触发CTL交叉抗肿瘤效应[7]，作为非细胞的外泌体用于基于DCs的免疫治疗引起了广泛关注。

以DCs为基础的肿瘤免疫治疗处于广泛临床研究阶段[8]，肿瘤免疫治疗的关键是寻找高效的肿瘤抗原制备成DCs疫苗。研究表明DCs被肿瘤抗原肽冲击，如甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）[8]，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（glypican 3，GPC-3）[9]和黑色素瘤相关抗原 1（melanoma antigen-1，MAGE-1）[10]，虽然显示一定的抗肿瘤效应，但是疗效有限。研究表明单个抗原肽很难引发免疫反应并有免疫逃逸的风险[11]，此外，该方法仅限于肿瘤相关抗原明确鉴定的肿瘤。为了克服这些限制，研究者们试图使用其他方法，例如使用肿瘤细胞裂解物来冲击DCs，第一次在人类肝癌患者使用肝癌细胞裂解物作为抗原冲击DCs，虽然取得一定的疗效，但是患者反应依然有限[12]。导致低效率的潜在原因尚不清楚。据报道肿瘤细胞衍生的抑制性因子[如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），白介素 10（interleukin，IL-10）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和生物因子（如半乳糖凝集素-1、吲哚胺2，3-双加氧酶和脂滴）]可抑制DCs成熟和T细胞活化[13-14]，这可能有助于解释接种肿瘤细胞裂解物制备的DCs疫苗缺少效率的原因。因此，寻找具有较强免疫原性同时含较少免疫抑制性物质的肿瘤抗原是开发基于DCs免疫治疗迫切需要的。

外泌体被认为是由多泡小体与细胞质膜融合后释放到细胞外的一种膜泡[15-16]，直径约30～150 nm，含有多种功能蛋白、mRNA和miRNA[17]，外泌体的蛋白质组成很大程度上反映了它们亲代细胞的蛋白质组成[18]，显示出特异性的细胞类型[7]。与全细胞裂解物相比，在肿瘤来源的外泌体中观察到富含肿瘤抗原如Melan-A[19]、Silv[7]、癌胚抗原[20]和间皮素[21]，实际上大多数肿瘤细胞释放的外泌体都含有肿瘤抗原，提示可以开发基于肿瘤外泌体的肿瘤疫苗。先前对肿瘤来源外泌体的研究集中于包括诱导T淋巴细胞凋亡和抑制NK细胞杀伤活性等一系列不利影响[22]，然而，越来越多的临床和实验结果表明肿瘤来源的外泌体携带大量的肿瘤抗原可激活DCs细胞，提高抗肿瘤免疫[23]。实际上，肿瘤来源的外泌体已经被作为肿瘤抗原脉冲DCs，导致肿瘤抗原转移到DCs，在小鼠中能够诱导CD8+T细胞依赖的抗肿瘤作用[33]。基于这种矛盾的观点一方面可能是在肿瘤进展的不同阶段肿瘤细胞分泌的外泌体所含有的内容物不同发挥作用不同，肿瘤细胞在发展或消退的过程都需要经历促肿瘤和抗肿瘤的平衡打破，另一方面外泌体在体内和体外所处的环境不同作用也会有差异。本研究也发现肿瘤的外泌体携带大量的肿瘤相关抗原和热休克蛋白如HSP90、HSP70。Srivastava等[24]已经证明，源自人类肿瘤细胞质的HSP70（HSP70及HSC70）和HSP90（gp96）可以激活T细胞介导的免疫应答。肿瘤的HSP是携带肿瘤抗原肽的伴侣蛋白，但是否是外泌体刺激DC成熟的关键蛋白还有待于进一步探讨。

DCs的成熟伴随着主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）类分子和共刺激分子的上调，DCs表现出有效的免疫原性表型，其特征在于释放IL-12[25]，分泌IL-12的DCs能触发强效T（Th1）和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）为主的免疫反应.[26]。我们的研究结果与此相一致，用外泌体冲击的DCs能够上调他们的CD分子的表达，介导T淋巴细胞增殖。因此来自HCC细胞的外泌体可能是调节DCs介导抗肿瘤免疫的重要抗原性物质。

CTL在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。一些报道显示肿瘤来源的外泌体构成了一种有效的肿瘤抗原递送系统，体外诱导肿瘤特异性CTL的杀伤效应并且在体内提供抗肿瘤的交叉保护[20]。在本研究中，我们发现外泌体冲击DCs体外诱导T淋巴细胞增殖并介导强烈的特异性肿瘤杀伤效应，与此同时，我们还发现其介导了一定的非特异性杀伤效应。因此推测HCC细胞的外泌体可以提供广谱的肿瘤抗原或免疫原性物质，可能为基于DCs的肝癌或其他肿瘤免疫治疗提供潜在的肿瘤抗原谱。