金匮肾气总苷中马钱苷吸收及代谢动力学过程＊

孙向明，宋 辉，胡 扬，丁晶鑫，李文兰＊＊

（1.哈尔滨商业大学药学院 哈尔滨 150076；2.哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心 哈尔滨 150076）

金匮肾气丸是张仲景《金匮要略》中的经典名方[1]，该处方由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、茯苓、牡丹皮、肉桂、附子（制）八药味组成，具有温补肾阳，化气行水之功效。时至今日仍被广泛运用于肾虚水肿，腰膝酸软，小便不利，畏寒肢冷。临床上用于治疗多种疾病，尤其是治疗肾阳虚以及由男性更年期综合征引发的一些病症[2-6]。前期实验表明，金匮肾气总苷类成分能显著增加肾阳虚型大鼠血清睾酮含量，提高SOD活性，降低MDA水平，是提高雄性大鼠性激素及抗衰老的主要有效部位[7]。

口服给药是中药方剂最主要的用药方式，决定药用价值的首要环节就是药物吸收的程度和速度。对复方潜在效应物质中主要成分进行代谢动力学研究，可有效评价潜在效应物质在体内的吸收、分布、代谢、排泄过程，具有整体、综合、动态和定量的特点，为设计和优化给药方案、保证临床用药的安全性和有效性和指导中药新药的开发设计等方面都具有重要意义。马钱苷是金匮肾气丸组方中山茱萸的有效成分，具有明显的抗炎、调节免疫、抗休克、强心等作用[8-10]，在金匮肾气总苷中的量约占7.25%[11]。鉴于马钱苷具有较强药理活性和药用价值，是总苷中含量较高的成分，且性质比较稳定，以原型成分入血发挥作用[12]，本文将以马钱苷作为金匮肾气丸总苷有效部位的代表成分进行肠吸收机制、影响因素以及药代动力学的研究。旨在揭示金匮肾气总苷药效物质的体内作用过程，以期提高总苷的生物利用度，为申报新药、进行临床研究提供科学依据。

1 材料

1.1 试药与仪器

所用药材熟地黄、山药、山茱萸、牡丹皮、泽泻、茯苓、附子（制）、肉桂均购于宝丰医药商业有限公司，并经哈尔滨商业大学张德连教授鉴定；马钱苷标准品购自中国药品生物制品检定所（含量＞98%，批号：111640-200502）（图1）；酚红购自上海研一生物科技有限公司（批号：20050602）；甲醇、乙腈、冰醋酸为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为双蒸水；Waters高效液相色谱仪（W2695泵、W2996DAD检测器）；751型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；DZK-2电热恒温振荡水槽（上海迈捷实验设备有限公司）；TDL80-2B高速离心机（上海宇工机械有限公司）；HL-2型恒流泵（上海嘉鹏科技有限公司）；Sartorius普及型pH酸度计PB-10（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；AR1140型电子天平（美国奥好斯科技有限公司）。

1.2 实验动物

雄性Wistar大鼠（220±20）g购自长春国家生物产业基地实验动物中心，合格证号：SCXK-（吉）2003-0004。实验前禁食12 h，自由饮水。

2 方法

2.1 总苷中马钱苷的在体肠吸收研究

2.1.1 总苷的制备

金匮肾气总苷由实验室制得：按处方比例精密称取药材，加入14倍量体积分数为58%的乙醇，回流提取3次，每次180 min，减压回收乙醇，采用紫外-可见分光光度计法进行总苷含量测定[11]，以马钱苷计乙醇提取物中总苷的含量为3.42%，加适量蒸馏水稀释成生药质量浓度为0.25 g·mL-1的药液，以稀盐酸调pH=6，上D-101型大孔吸附树脂柱充分吸附后，用30 BV、pH=8的70%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，干燥得总苷，总苷（以马钱苷计）占总洗脱物的43.87%。

2.1.2 溶液的制备

缓冲液：精密称取 NaCl6.87 g，KCl0.4 g，NaHCO32.2 g，NaH2PO40.13 g，MgSO40.122 g，CaCl20.25 g，葡萄糖5 g置1 000 mL容量瓶中，加适量蒸馏水超声溶解，补足蒸馏水定容至刻度，作为循环液备用。

酚红系列标准溶液：精密称取酚红适量，缓冲液稀释成质量浓度为100 mg·L-1的储备液备用，分别精密吸取酚红储备液适量，用缓冲液稀释成质量浓度为10、20、30、40、50 mg·L-1的酚红系列标准溶液，置冰箱4℃冷藏，备用。

图1 马钱苷结构式

图2 马钱苷及酚红溶液的紫外吸收光谱图（1-马钱苷2-酚红）

总苷供试品溶液：称取不同量的总苷浸膏，将其溶于20 mg·L-1的酚红溶液中，以3 000 r·min-1转速离心5 min，取上清液，制得低（含总苷0.17 mg·mL-1）、中（含总苷0.51 mg·mL-1）、高（含总苷1.87 mg·mL-1）3种质量浓度的总苷供试品溶液。

2.1.3 酚红检测波长的选择及标准曲线绘制

用缓冲液将酚红和马钱苷标准品配成适当浓度，扫描其紫外吸收光谱图，扫描波长范围为200-600 nm。酚红的最大吸收波长在558 nm处，马钱苷在此处几乎没有吸收（图2）。因此，确定酚红的检测波长为558 nm。精密吸取酚红系列标准溶液各0.5 mL，分别加入NaOH溶液（摩尔浓度为0.20 mol·L-1）5.0 mL，摇匀，在酚红的最佳检测波长处测定吸光度，以酚红质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到酚红的线性回归线方程为 Y=0.018X+0.042 9，R=0.999 9，（n=5）。表明酚红在10-50 mg·L-1内线性关系良好。

2.1.4 色谱条件

色谱 柱：Symmetry C18柱（3.9 mm × 150 mm，5 μm）；流动相：0.1%冰醋酸水溶液-甲醇（80∶20）；柱温：30℃；流速：0.8 mL·min-1。检测波长为237 nm。

2.1.5 马钱苷标准曲线绘制

图3 马钱苷标准品（A）、总苷供试品（B）及空白循环液（C）的液相色谱图

精密称取马钱苷标准品2.0 mg置10 mL容量瓶中，用缓冲液稀释定容，作为马钱苷储备液。再取适量储备液，分别稀释成质量浓度为0.10、0.08、0.04，0.02、0.01 mg·mL-1的标准品溶液。用0.45 μm微孔滤膜过滤后，在2.1.4项下的色谱条件下进样10 μL，记录马钱苷的峰面积，以峰面积对质量浓度进行线性回归，得到线性方程为：Y=2×106X-41 688,R=0.999 8，（n=3）。表明马钱苷在0.01-0.10 mg·mL-1范围内线性关系良好。

2.1.6 方法学考察

马钱苷的专属性实验：在2.1.3项下的色谱条件下，马钱苷的保留时间为10.66 min，空白循环液在该位置无干扰峰（图3），总苷的色谱图中在同一保留时间可见马钱苷的峰，且与其他组分达到基线分离，分离度大于1.5，理论塔板数按马钱苷峰计不低于5 000。

精密度实验：精密吸取质量浓度为0.04 mg·mL-1的马钱苷标准品溶液，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液10 μL，连续进样5次，计算峰面积的RSD值为0.17%，小于2%，精密度良好。

稳定性实验：取质量浓度为0.20 mg·mL-1的马钱苷标准品溶液，分别于0、6、12、18、24、30 h取样，计算峰面积的RSD值为0.74%，小于2%，表明30 h内马钱苷稳定性良好。

回收率实验：取已知含量的样品溶液3份，分别加入不同体积质量浓度为0.04 mg·mL-1的马钱苷标准品溶液，使加入马钱苷的量达到样品中马钱苷含量的80%、100%、120%，测定样品中马钱苷的量，马钱苷平均回收率为99.62%，RSD值为1.09%，小于2%，表明该方法的准确度良好，满足测定要求。

2.1.7 大鼠在体肠吸收实验[13,14]

将实验动物分为11组：总苷低、中、高剂量组（含马钱苷质量浓度分别为 0.01 mg·mL-1、0.03 mg·mL-1、0.11 mg·mL-1）；循环液pH值6、7、8组（含马钱苷质量浓度均为0.01 mg·mL-1）；十二指肠、空肠、回肠组（含马钱苷质量浓度为0.01 mg·mL-1）；P-gp诱导剂利福平组和P-gp抑制剂维拉帕米组（含马钱苷质量浓度为0.01 mg·mL-1，含利福平或维拉帕米质量浓度为0.10 mg·mL-1）。将大鼠禁食不禁水12 h，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.003 mL·g-1），固定，置加热器上随时调温以保持体温。沿腹腔中线打开腹腔，结扎胆总管，并分离出所需肠段，于切口处插管（出液口插管约3 cm），结扎。首先用适量的生理盐水将小肠内容物冲洗干净，然后用预热至37℃的循环液以5 mL·min-1的速度恒定流速平衡10 min，再以空气排净，将伤口用浸有生理盐水的脱脂棉覆盖保湿，于红外灯下保持大鼠体温。各组循环液30 mL保持（37±5）℃恒温，以5 mL·min-1循环10 min后，记为0时，后循环液以1 mL·min-1的流速循环160 min。分别于 20、40、60、80、100、120，140、160 min时取循环液2 mL，用微孔滤膜过滤后，取滤液1 mL进样，测定各时间点循环液中马钱苷的量。同时，取0.5 mL滤液测定酚红的量，同时补加2 mL酚红溶液。最后将大鼠处死，剪下被灌流肠段，测量肠内径及长度。采用上述实验方法分别考察马钱苷浓度、pH值、肠段及P-gp各因素对总苷中马钱苷在体肠吸收的影响规律。以马钱苷剩余药量的对数值对取样时间作线性回归，由斜率求得吸收速率常数Ka，由剩余药量可以求得药物吸收量。采用SPSS18.0软件对各组数据进行统计处理，并进行单因素方差分析。

2.2 总苷中马钱苷的药代动力学研究

2.2.1 灌胃药液的制备

取总苷浸膏适量，用蒸馏水制成低、中、高浓度的总苷灌胃液，浓度分别为：0.17 g·mL-1（马钱苷浓度10 mg·mL-1），0.26 g·mL-1（马钱苷浓度15 mg·mL-1），0.35 g·mL-1（马钱苷浓度20 mg·mL-1）。取高浓度的总苷灌胃液，加入适量维拉帕米，使其终浓度为1 mg·mL-1，作为维拉帕米+总苷组的灌胃药液。

2.2.2 色谱条件

色谱柱：Symmetry C18(150 mm×3.90 mm，5 μm)，柱温：30℃，流速1 mL·min-1，检测波长为237 nm。流动相条件：乙腈：1%醋酸水（8∶92）。

2.2.3 标准曲线的绘制

精密称取马钱苷对照品0.84 mg，以甲醇溶解并定容至50 mL，配制成16 800 ng·mL-1的标准储备液，分别精密吸取马钱苷标准储备液 50、200、500、750、2 500、4 750、6 250 μL，以甲醇梯度稀释并定容至10 mL，制备成质量浓度为84、336、840、1 260、4 200、7 980、10 500 ng·mL-1的系列溶液，精密吸取系列溶液200 μL，加至离心管中，挥干，加入大鼠空白血浆200 μL，混匀振荡1 min，加入100 μL 6%高氯酸沉淀蛋白，于混匀振荡器上振荡1 min，以14 000 r·min-1转速离心15 min，在2.2.2项下的色谱条件下取上清液50 μL进样分析。以测定的峰面积（Y）为纵坐标，马钱苷浓度（X，ng·mL-1）为横坐标进行线性回归。马钱苷血药浓度标准曲线的回归方程为Y=63.979X-4 661.2，R=0.999 7，线性范围84～10 500 ng·mL-1。在此色谱条件下，测得马钱苷的最低检测浓度为78 ng·mL-1。

2.2.4 方法学考察

专属性实验：取空白血浆、给药后的血浆以及加入适量马钱苷的血浆各200 μL，按2.2.3项下“振荡1 min”之后的步骤处理并进样分析，色谱（图4）（1号峰马钱苷的保留时间为9.58 min），经比较可知血浆中的内源性杂质与总苷内的其他成分对马钱苷的测定没有干扰。说明本法具有较高的专属性。

精密度、稳定性及回收率实验：在一日或日间（3天）不同时间点，按标准曲线项下操作配制马钱苷高（接近标准曲线上限）、中、低（接近最低检测限）三个浓度的血浆溶液，每个浓度5份，按2.2.3项下“振荡1 min”之后的步骤操作。测得马钱苷的日内精密度RSD值为3.56%，日间精密度RSD值为4.58%（n=5），5 h内的稳定性RSD值为5.86%。总苷中马钱苷的绝对回收率为88.93%，RSD值为2.75%；相对回收率为96.2%，RSD值为3.73%。上述数据结果表明样品稳定性良好，实验所采用的方法精密度、回收率均符合生物样品的检测要求。

图4 马钱苷标准品血浆（A）、总苷给药后血浆（B）及空白血浆（C）的液相色谱图

2.2.5 药代动力学研究

Wistar大鼠禁食12 h，以各剂量组要求按10 mL·kg-1灌胃给药，分别于给药后10、20、30、45、60、90、120、180、240、360 min由眼眶静脉丛取血0.5 mL，置肝素化的离心管内，轻轻转动约1 min，以3 000 r·min-1转速离心10 min，取上清液，于-20℃冻存。将冻存血浆取出置于4℃下缓慢解冻，取200 μL血浆，按2.2.3项下“振荡1 min”之后的步骤处理并进样分析。

3 结果与分析

3.1 总苷中马钱苷在体肠吸收研究

3.1.1 浓度对总苷中马钱苷吸收的影响

肠道的平均pH值为7.4，故在循环液pH值为7.4生理条件下，采用全肠段循环灌流法，考察药物低（含马钱苷0.01 mg·mL-1）、中（含马钱苷0.03 mg·mL-1）、高（含马钱苷0.11 mg·mL-1）3个质量浓度时总苷中马钱苷的吸收规律。数据（表1）。

经线性回归统计，马钱苷的吸收量对质量浓度的回归方程为：Y=652.32X-5.653 2（R=0.999 3），表明马钱苷在0.01-0.11 mg·mL-1范围内，各浓度的吸收量与药物浓度呈良好线性关系。经方差分析，吸收速率常数无显著性差异（P＞0.05），符合线性一级动力学过程，提示马钱苷在该范围内的吸收过程为被动扩散过程。

表1 金匮肾气总苷中马钱苷的吸收量及吸收速率（n=5）

表2 不同pH值下总苷中马钱苷的吸收量及吸收速率（n=5）

表3 不同肠段总苷中马钱苷的吸收量及吸收速率（n=5）

表4 利福平及维拉帕米对总苷中马钱苷吸收量及吸收速率的影响（n=5）

图5 灌胃3个剂量总苷后马钱苷血药浓度-时间曲线图

3.1.2 pH值对总苷中马钱苷吸收的影响

用稀盐酸和稀氢氧化钠溶液调节总苷样品溶液（含马钱苷质量浓度为0.01 mg·mL-1）的pH值分别为6、7、8，全肠段循环灌流，考察循环液的pH值对马钱苷的吸收量及吸收速率影响的情况（表2）。

总苷中马钱苷的吸收量及吸收速率在循环液的pH值为6-8范围内无显著性差异（P＞0.05）。表明马钱苷的吸收不受环境酸碱度的影响，符合苷类成分的特征（表2）。

3.1.3 肠段对总苷中马钱苷吸收的影响

结扎所需肠段：十二指肠段自幽门1 cm处开始，空肠段自幽门15 cm处开始，回肠段为盲肠上行20 cm处开始，各段均向下取约10 cm，取pH=7.4的总苷样品溶液（含马钱苷质量浓度为0.01 mg·mL-1），应用分肠段灌流法[15]考察总苷中马钱苷在各个肠段的吸收情况（表3）。

结合表3分析可知：总苷中马钱苷在十二指肠肠段的吸收明显优于空肠及回肠肠段（P＜0.05），而后两者无显著性差异（P＞0.05）。

3.1.4 P-糖蛋白（P-gp）对总苷中马钱苷吸收的影响

取pH=7.4的总苷样品溶液（含马钱苷质量浓度为0.01 mg·mL-1，含利福平或维拉帕米质量浓度为0.10 mg·mL-1）为循环液，考察总苷中马钱苷在与P-gp诱导剂或抑制剂合用时与单独用药时吸收情况的差异（表4）。

利福平与维拉帕米分别作为P-gp的诱导剂与抑制剂，结合（表4）中数据分析可知：利福平组马钱苷的吸收量及吸收速率较对照组有显著降低（P＜0.01），维拉帕米组马钱苷的吸收量及吸收速率较对照组有显著升高（P＜0.01)），即与马钱苷合用时分别呈现出对药物吸收的抑制和促进作用。

3.2 总苷中马钱苷的药代动力学研究

大鼠灌胃给予3个剂量总苷及维拉帕米+总苷后，按2.2.5项下方法实验，采用3P97程序进行数据处理，经模型拟合，确定马钱苷最佳模型为一室开放模型，得到马钱苷在大鼠血浆中的药时曲线（图5）所示，各组主要的代谢动力学参数（表5）。

根据表5的药动学参数，总苷低剂量组马钱苷Cmax为 3 556.9 ng·mL-1，药时曲线下面积（AUC0-∞）为0.35 mg·min·mL-1，相比之下，中剂量组Cmax提高了1.48倍，AUC0-∞提高了2.06倍；高剂量组Cmax提高了2.04倍，AUC0-∞提高了2.15倍，表明各剂量组马钱苷的药动学行为成线性关系。经模型拟合，以AIC值最小原则结合相关指数、相关系数等指标确定总苷中马钱苷的最佳模型为一室开放模型。经SPSS软件验证，各剂量组间主要动力学参数无显著性差异，Ka为0.04 min-1，Ke为 0.01 min-1，T1/2Ke为 81 min，Tmax为 54 min。以低剂量组各药动学参数分析可知：马钱苷吸收入血较快，52 min即可达到最大血药浓度Cmax3 556.9 ng·mL-1，以一室开放模型在体内分布，T1/2Ke为 85 min，CL/f（s）为0.34 L·min-1·kg-1，表明马钱苷在大鼠体内消除较快。

表5 金匮肾气总苷中马钱苷的药动学参数（n=5）

总苷高剂量组Ka为0.04 min-1，Ke为0.01min-1，Tmax为52 min，T1/2Ke为78 min，Cmax为7 271.4 ng·mL-1，而与维拉帕米合用后，Ka为0.08 min-1，Ke为0.01 min-1，Tmax为 35 min，T1/2Ke为 85 min，Cmax为 10 443.1 ng·mL-1，AUC0-∞增加了0.7倍，经SPSS软件验证，维拉帕米对总苷中马钱苷的Tmax、Cmax、Ka、AUC0-∞等药动学行为有显著影响（P＜0.05）。尤其是吸收过程，可显著增加马钱苷的吸收速率和吸收量，提高了马钱苷的吸收速度和生物利用度，从药动学的角度验证了马钱苷在大鼠体内的吸收过程受到P-gp外排作用的影响。

4 讨论

在肠吸收的过程中，不仅药物会被吸收，水分也会被吸收，使循环液体积减少，致使无法通过测定药物质量浓度来计算药物的剩余量。而酚红在小肠内几乎不被吸收，可用于标定循环液的体积[16]。因此，本实验中向循环液中加入已知量的酚红，通过测定不同时间点的酚红的质量浓度，推算循环液的实际体积，从而准确的计算剩余马钱苷的量。

维拉帕米是P-gp的抑制剂，与金匮肾气总苷合用后，能显著升高总苷中马钱苷的吸收量及吸收速率，呈现出对药物吸收的促进作用。在药动学研究中，合用维拉帕米后，Tmax、Cmax、Ka、AUC0-∞等参数均显著增加，表明马钱苷的吸收确实受P-gp的影响，提示在临床用药时可以与维拉帕米等抑制剂合用，以提高其生物利用度，增强药物疗效。在不同肠段吸收的研究中，总苷中马钱苷在十二指肠肠段的吸收明显优于空肠及回肠肠段，提示总苷中马钱苷吸收也具有位置选择性，可制成控释制剂以提高其药效。由于总苷为金匮肾气丸的有效部位，且疗效显著，今后更易于应用于临床，因此，可根据总苷中马钱苷的吸收部位选择性，通过控制其释药部位来提高总苷中马钱苷的药效。

山茱萸是金匮肾气丸的组方药味，通过查找相关文献[17]，进一步与山茱萸提取物中马钱苷的大鼠药代动力学比较发现：金匮肾气总苷中和单味药山茱萸中的马钱苷的药代动力学模型均符合一室模型，山茱萸中马钱苷的达峰时间为33.90 min，吸收半衰期为12.47 min，消除半衰期为52.45 min，而总苷中马钱苷低剂量组的对应参数分别为52.28 min、19.55 min、84.79 min，相比之下均略高于前者，提示马钱苷在复方有效部位中的吸收和消除过程变缓，在体内作用时间延长，推测可能由于受到复方中其他药味及成分的影响，表明中药复方最终药效的发挥是各药物各成分之间的一种综合作用和效应。总体而言，马钱苷在山茱萸和金匮肾气总苷中的吸收和消除均较快。

依据药代动力学和在体肠吸收机制研究，揭示了金匮肾气总苷有效部位的ADME机制，充分证明BS总苷的吸收受到P-gp外排作用的影响。通过参考肠吸收动力学及药物动力学参数，指导新药的设计，正确地阐明药物的剂型和生物因素与药效的关系，以评价药物制剂的质量，设计合理的剂型，保证临床用药的安全性和有效性，以期开发出生物利用度高的有效制剂。