代谢组学在中医寒、热证型实质研究中的应用进展＊

钱文娟，林丽丽，汪受传，狄留庆，单进军＊＊

（1.江苏省儿童呼吸疾病（中医药）重点实验室，南京中医药大学中医儿科学研究所 南京 210023；2.南京中医药大学药学院 南京 210023）

寒、热作为反映疾病性质的一对纲领，在指导疾病的诊断、治疗过程中起着重要的作用。代谢组学可通过现代生物分析方法及生物信息分析策略研究生物样本中代谢物的变化，寻找生物标志物，进而在代谢物及代谢通路水平上阐释中医寒、热证型的实质，并建立精准量化的“证”的标准。本文总结了近年来基于代谢组学技术研究中医寒、热证型实质的研究，对所存在的问题及发展趋势进行了分析与展望。

1 寒、热证型简介

寒热理论源于《内经·阴阳应象大论》的“阳胜则热，阴胜则寒”，《素问·五常政大论》提出“治热以寒，温而行之；治寒以热，凉而行之”；自《伤寒论》起逐步完善，开创方药，如半夏泻心汤、大青龙汤、黄土汤等；确立于宋元明清等多位医家著作，并不断继承创新至今，是贯穿于中医学基础理论的重要纲领，涉及中医病、症、证、治各个方面。

寒证，是疾病的本质属于寒性的证候，可以由感受寒邪所致，也可以由机体自身阳虚阴盛而致，表现为机体机能活动衰减的证候。包括表寒、里寒、虚寒和实寒等证。寒证往往表现为无热、恶寒、下利、不渴、小便清长、手足厥冷、面色苍白、脉象微细等。热证可以由外感阳热之邪或寒湿等邪化热，或气郁化热，或食积化热等阳盛阴虚所致，表现为机体机能活动亢进的证候。包括表热、里热、虚热和实热等证。热证常表现为高热、便闭、口渴喜饮冷、小便短赤、颜面潮红，脉象洪数等。

2 代谢组学简介

代谢组学与基因组学、转录组学和蛋白质组学共同构成了系统生物学的核心内容。基因组、转录组及蛋白组为生物过程提供物质基础，而代谢组信息则提示生物进程中已经发生的物质改变[1]。代谢组学分析流程包括样本收集及预处理、检测分析及数据采集和数据处理及解释。代谢组学研究对象是小分子内源性代谢物，样本包括体液（血液、尿液、唾液、淋巴液[2]、脑脊液[3]、关节腔液[4]等）、细胞、组织、粪便[5]等生物样本。常用的代谢组学分析工具主要是质谱（MS）、液-质联用（LC-MS）、气-质联用（GC-MS）和核磁共振技术（NMR）等。其中色谱具有分离度高、检测效率高等特点；质谱可实现高选择性和低检测限；核磁共振具有非破坏性、非选择性的优势。数据处理的基本策略是化学计量学和多元统计结合[6]，对多维大数据进行降维和归类分析，并根据P值、Fold Change值和VIP值筛选显著改变的代谢物。同时，联合应用代谢数据库如NIST、HMDB、KEGG等搜寻代谢物相关生物功能及代谢通路，确定与疾病密切相关的潜在生物标记物（群）和代谢通路。

3 代谢组学与中医寒、热证型实质的关联

中医“证”是对当前病因、病位、病性、病势等全局性的、病理性的概括。因此，对于中医寒、热证型实质的研究需从整体的角度出发。“证”的标准化、客观化研究历来是中医研究的热点[8]。从古至今，临床中医证型主要由医者的主观经验判定，很难标准量化。临床科研研究采用流行病学的方法，将中医“望闻问切”四诊所获得的信息进行整理，总结出一些普遍性的临床症状，建立诊断标准。但是这种诊断的准确性很大程度上依赖于医生的临床经验，影响了“证”标准的可靠性与准确性[9]。因此，需要建立整体的、精准量化的中医“证”的标准。

代谢组学，具有整体性和系统性的特点，已被广泛运用到探索寒、热证型的科学内涵中来。其通过高分辨、高通量、高灵敏度的分析手段，定性或定量监测体液、组织或细胞、菌群中内源性小分子物质（分子量＜1 kDa），探索机体在受到外部环境或疾病状态影响下的动态变化，并找到潜在生物标志物（群）及相关代谢通路[10,11]。运用代谢组学技术可从代谢物及代谢通路角度阐释中医寒、热证的本质，并建立精准量化的“证”的标准。

4 临床寒、热证实质的代谢组学研究

近年来，临床上运用代谢组学研究疾病的寒、热证型取得了重要进展，所研究的疾病类型多，涉及呼吸系统疾病（过敏性鼻炎、肺炎、支气管哮喘）、痛经、关节炎、肝炎、肾炎、胃病、银屑病及亚健康等。研究人员首先根据诊断标准筛选研究对象并分组。在诊断标准中，包括疾病西医诊断标准、中医证型诊断标准及病例纳入排除标准。其次是样本采集，临床上采集的样品主要是晨起空腹血和尿。最后利用GC-MS、LC-MS及1H-NMR技术对寒证患者及健康志愿者，热证患者及健康志愿者或同一疾病下寒、热证型的患者的生物样本进行分析，监测出寒、热证代谢谱的差异，获得与人体疾病、证型分类密切相关的生物标志物（群）。关于寒、热证型的临床代谢组学研究见表1。综合寒、热证代谢谱中显著性改变的代谢物可见，氨基酸、糖、脂质、脂肪酸及胺类的代谢紊乱，主要参与的代谢通路有氨基酸合成、氮代谢、甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢、丙氨酸，天冬氨酸、谷氨酸代谢、酮体合成和降解、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、半乳糖代谢、糖酵解和糖异生及丙酮酸代谢等，同一证型下不同疾病的代谢物改变趋势不同，如原发性痛经的寒证证型中，虚寒和实寒的患者与正常机体间的差异性代谢物均有乳酸、葡萄糖、果糖、异柠檬酸、甘氨酸、原藻醇和马尿酸，但是代谢趋势相反；又如虚寒证中，过敏性鼻炎的代谢组学研究中肌醇的含量显著升高，而类风湿性关节炎的代谢组学研究中，肌醇的含量显著降低，提示“虚、实”证、不同疾病（“脏、腑”）可影响寒、热证代谢表型，影响寒、热证型实质的研究。

5 动物模型寒、热证实质的代谢组学研究

中医证候动物模型是在中医整体观念及辨证施治思想的指导下，运用脏象学说和中医病因、病机理论，在动物体上模拟和复制人类各种临床症候[12]。建立相应的中医证候动物模型，分析其生物样本，筛选出中医证候相关生物标记物，有利于进一步探索寒、热证型实质，为临床诊断及治疗提供依据。一般将造模方法划分为西医病因病理造模、中医病因病机造模和病症结合造模3类，具体的造模方法多样，包括使用生化制品或中药制剂、调控饲养环境、情志刺激等[13]。在动物模型寒、热证的代谢组学研究中（表2），动物模型多样，包括西医病因病理模型如干酵母热证模型；中医病因病机模型如寒冷环境联合冰水游泳及寒冷饮食的外寒内饮证模型和病症结合模型如高糖高脂、高温高湿联合大鼠腹腔注射产肠毒性大肠杆菌的大肠湿热模型。动物模型中显著改变的代谢物主要是氨基酸、糖、脂质、脂肪酸及胺类等，代谢物主要参与的代谢通路有TCA循环、甘氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢、氨基酸合成等，但是同一疾病模型不同的造模方式所获取的代谢物改变趋势不同，如类风湿性关节炎寒证模型中，采用卵蛋白联合低温冷冻造模方法时，代谢物亮氨酸含量显著升高，棕榈酸含量显著降低，而使用牛Ⅱ胶原蛋白联合弗氏完全佐剂造模方法时，亮氨酸含量则显著降低，棕榈酸含量显著升高，提示采用动物模型研究寒、热证实质时，代谢组学研究所筛选得到的寒、热证潜在生物标记物（群）和代谢通路还不能直接用于揭示人体寒、热证实质。

表1 临床寒、热证的代谢组学研究

续表1

表2 动物模型寒、热证代谢组学研究

续表2

6 问题与展望

目前代谢组学技术已广泛应用于探索中医寒、热证型实质并取得一定成就，但依然存在问题：（1）单纯使用一种分析仪器或方法，只能得到部分代谢物的信息，致使同一样本应用不同分析方法找出的生物标记物（群）不同。因此，需结合多种分析技术进行代谢物全谱的检测：可采用LC-MS技术和NMR技术相结合[14]，GC-MS技术和LC-MS技术联合[15]，综合非靶向和靶向代谢组学模式[16]，增强代谢物检测覆盖率。（2）寒、热证动物模型的建立与评价仍处于探索阶段，对于动物证候模型的评价指标及可重复性存在争议，证候动物模型对人体临床证候的模拟程度也未得到公认。因此，对造模动物进行代谢组学研究所筛选得到的寒、热证潜在生物标记物（群）和代谢通路还不能直接用于揭示人体寒、热证实质，仍需进一步结合临床研究。（3）同一证型下不同疾病所得潜在生物标记物（群）种类差别大，且回调趋势不一致，难以解释寒、热证型规律及实质。因此，需采用代谢组学联合蛋白质组学、基因组学、转录组学等多组学研究方法，从基因-转录-蛋白-代谢角度整体探索寒、热证实质。