超高效液相色谱-串联质谱法同时测定保健食品中丙磺舒、别嘌醇和苯溴马隆

2019-01-29邓幸飞李锦清

色谱 2019年2期

邓幸飞, 綦艳, 李锦清, 张燕, 熊波, 刘辉*

(1. 广东产品质量监督检验研究院, 国家食品质量监督检验中心(广东), 广东佛山 528300; 2. 华南农业大学, 广东广州 510642)

不法商贩为提高保健功效、降低成本、牟取暴利,在保健食品中非法添加化学药物,成了制约保健食品行业健康发展的关键问题[1,2]。在减肥类、补肾壮阳类等保健食品中检出化学药物的事件时有发生[3,4]。近年来,随着痛风发病率的上升导致了抗痛风类保健食品的产业不断增大。因此加强抗痛风类保健食品中化学药物的监测刻不容缓。

反复发作的慢性痛风患者常用的治疗药物有别嘌醇、丙磺舒和苯溴马隆等[5,6]。这3种化学药物均为处方药,长期服用,将对肝肾功能产生很大的毒副作用,并有加重心脑血管疾病等风险[7,8]。

目前,国内外检测别嘌醇、丙磺舒和苯溴马隆的主要方法有液相色谱法、质谱法、气相色谱法和毛细管电泳法等,检测对象主要是血液、尿液等生物样品[9-14],而对保健食品中痛风药物成分的研究甚少。张秋炎等[15]采用HPLC-MS/MS测定中成药与保健食品中非法添加的9种尿酸调节类药物,该方法中别嘌醇和丙磺舒的检出限分别为300 μg/kg和200 μg/kg,但对苯溴马隆药物未进行检测。杨园园等[16]采用液相色谱法检测抗痛风类保健食品,发现部分含有激素类的化学药物,但该方法也未对别嘌醇、丙磺舒和苯溴马隆进行检测。因此建立一种检测全面、灵敏度高的方法应用于保健食品中慢性痛风药物的筛查和测定变得尤为必要。

QuEChERS方法是一种最早用于蔬菜水果中农药残留检测的前处理方法,近年来经改良后开始应用于保健食品中违禁药物残留的测定[17,18]。抗痛风类保健食品中常含有多种动植物提取物以及加工过程中添加的各种辅料,基质成分比较复杂。因此,本文通过QuEChERS方法对样品进行净化,以降低基质效应,提高方法的灵敏度,并建立了UPLC-MS/MS同时测定抗痛风类保健食品中丙磺舒、别嘌醇、苯溴马隆3种药物的检测方法,填补了抗痛风类保健食品中苯溴马隆的检测空白,为强有力打击制假售假行为提供技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

UPLC-Xevo TQ超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Waters公司); JP-C600超声波清洗机(广州吉普超声波电子设备有限公司); 3-18K高速冷冻离心机(美国Sigma公司); DT-502A电子天平(常熟市金羊砝码仪器有限公司); IKA MS3漩涡混合器(德国IKA公司)。

乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、石墨化炭黑(GCB)、十八烷基键合硅胶(C18)吸附剂(40～60 μm,美国Agilent公司);丙磺舒、别嘌醇、苯溴马隆(纯度均≥97%,德国Ehrenstorfer公司);甲醇、乙腈(色谱纯,美国Sigma公司);甲酸(优级纯,德国CNW公司);氨水(质量分数25%,广州化学试剂有限公司);实验用水为二级蒸馏超纯水。

1.2 实验条件

1.2.1标准溶液的配制

分别准确称取10.0 mg丙磺舒、别嘌醇和苯溴马隆标准品,置于100 mL棕色容量瓶中,先加入1 mL氨水溶液,再加入适量甲醇溶解,最后用甲醇稀释定容,配制成质量浓度为0.1 g/L的混合标准储备液,于4 ℃下避光保存,有效期2个月。使用前恢复至室温,根据需要进行稀释,用空白基质溶液配制成混合标准工作液,现用现配。

1.2.2样品前处理

去除胶囊类抗痛风保健食品的囊壳,保留内容物,经充分混合后准确称取样品2.0 g,置于50 mL离心管中,加入5 mL含0.1%(v/v)氨水的乙腈溶液和1 g NaCl,涡旋振荡混合1 min,再超声提取5 min,以8 000 r/min离心5 min,收集上清液,置于离心管中,再加入5 mL含0.1%(v/v)氨水的乙腈溶液重复上述提取操作,合并两次上清液。加入100 mg PSA、50 mg C18吸附剂和1 g无水Na2SO4,涡旋混合3 min,以8 000 r/min离心5 min;移取上清液5 mL至玻璃试管中,于40 ℃下氮气吹干,用1 mL含0.1%(v/v)氨水的乙腈溶液复溶,上清液过0.22 μm有机滤膜,待测。

1.2.3色谱条件

色谱柱:菲罗门Kinetex C18柱(100 mm×4.6 μm, 2.6 μm);柱温:40 ℃;样品室温度:15 ℃;流动相:(A)甲醇和(B)0.1%(v/v)甲酸水溶液;流速:0.20 mL/min。梯度洗脱程序:0～2 min, 5%A; 2～6 min, 5%A～80%A; 6～9 min, 80%A; 9～10 min, 80%A～5%A。进样体积:10 μL。

1.2.4质谱条件

离子源:电喷雾电离(ESI)源;离子化方式:ESI+和ESI-;检测模式:多反应监测(MRM)模式;离子源温度:150 ℃;检测器电压:2.83 kV;离子源电压:正离子模式+4.5 kV,负离子模式-3.5 kV;脱溶剂气温度:500 ℃;脱溶剂气流量:800 L/h;碰撞气流量:0.13 mL/min。别嘌醇采用ESI+、MRM模式监测,监测时间为0～5.52 min;丙磺舒、苯溴马隆采用ESI-、MRM模式监测,监测时间为5.62～12.00 min, ESI+与ESI-同时扫描,切换时间为0.01 min。丙磺舒、别嘌醇和苯溴马隆的质谱参数见表1。

表 1 丙磺舒、别嘌醇和苯溴马隆的质谱参数

* Quantitative ion pair.

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

分别在ESI+和ESI-模式下对丙磺舒、别嘌醇和苯溴马隆3种药物的混合标准工作液进行电离检测,通过调节仪器参数使母离子的丰度达到最大,进一步对子离子进行二级质谱扫描,得到碎片离子信息,选取相对丰度较强、干扰较小的两对子离子作为定性、定量离子(见表1),使3种药物的灵敏度达到最佳。结果发现别嘌醇在ESI+模式下有更好的响应,而丙磺舒和苯溴马隆在ESI-模式下有更好的响应。

2.2 流动相的选择

本文选用常见的甲醇和乙腈作为有机相,为提高待测物的离子化效率,同时改善峰形,通常在流动相中添加少量的挥发性酸、碱或盐。本文考察了甲醇和0.1%(v/v)甲酸水溶液、乙腈和0.1%(v/v)甲酸水溶液、甲醇和0.1%(v/v)氨水水溶液、甲醇和0.1%(v/v)乙酸铵水溶液作为流动相,对3种药物的色谱保留行为和离子化程度的影响。结果表明,在流动相中添加氨水或乙酸铵时,丙磺舒和苯溴马隆响应强度较好,但峰形展宽并拖尾严重,且别嘌醇响应较低,不适合同时分离;而添加适量甲酸时,虽然丙磺舒和苯溴马隆的响应稍有降低,但别嘌醇响应较高,可同时将3种药物分离,且峰形对称。此外,虽然使用乙腈作为有机相比使用甲醇时3种药物的分离度和峰形更好,但丙磺舒、苯溴马隆的响应值较甲醇作为有机相时有所降低,综合考虑3种药物的特性,最终选择甲醇和0.1%(v/v)甲酸水溶液作为流动相。图1为丙磺舒、别嘌醇和苯溴马隆标准品的总离子色谱图,可见3种药物分离效果良好,峰形对称。

图 1 丙磺舒、别嘌醇和苯溴马隆标准品的总离子色谱图Fig. 1 Total ion chromatograms of probenecid, allopurinol and benzbromarone

2.3 前处理条件的优化

2.3.1提取液的选择

别嘌醇、丙磺舒和苯溴马隆3种药物在水和很多常见有机溶剂中溶解性较差,加入酸或碱后溶解度增加[19]。为了提高3种药物的提取效率,在样品前处理提取过程中分别加入甲醇、乙腈、含0.1%(v/v)氨水的乙腈溶液、含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液、含0.1%(v/v)氨水的甲醇溶液、含0.1%(v/v)甲酸的甲醇溶液进行超声提取,重复3次,考察6种提取液对3种药物回收率的影响(见图2)。结果显示,单独使用甲醇或乙腈作为提取液时,可能因为对药物的溶解度较低导致3种药物整体回收率偏低,且回收率随着药物浓度的增加而降低。当提取液中添加了氨水或者甲酸时,3种药物的回收率明显提高,其中甲酸可有效提高苯溴马隆的回收率,氨水可有效提高别嘌醇和丙磺舒的回收率。对比3种药物的整体回收率,发现当选择含0.1%(v/v)氨水的乙腈溶液作为提取液时,别嘌醇、丙磺舒和苯溴马隆的添加回收率分别为97.7%、103.0%和89.5%,符合GB/T 27404-2008标准对回收率范围的要求。

图 2 提取液对胶囊样品中3种药物回收率的影响Fig. 2 Effect of extraction solvents on the recoveries of the three drugs in capsule samples

2.3.2净化方法的优化

QuEChERS方法常用的吸附剂主要有PSA、GCB和C18等,吸附剂种类及含量是影响QuEChERS方法的重要因素[20]。PSA主要用于吸附样品中的脂肪酸、有机酸、糖和酚类等,还可吸附部分极性色素；GCB主要用于去除样品中的色素等,对极性化合物的吸附作用较强,特别是对含有芳香环及对称性结构的化合物；而C18对去除样品中的蛋白质和脂类成分有较好的效果[21,22]。因此,在样品前处理净化过程中,分别加入不同种类和含量的吸附剂,重复3次,考察吸附剂对回收率的影响(见图3)。结果发现,PSA和C18的组合能够满足净化需求,这可能与痛风类保健食品主要以脂类和植物提取物为主有关。而当加入GCB作为净化剂时,发现样品检测图谱中杂峰较少,但是3种药物的回收率明显降低,这可能与GCB粉末对3种药物都有很强的吸附能力有关。在选择剂量方面,发现随着剂量的上升,基质的抑制作用逐渐降低,回收率升高,但再增加吸附剂的含量,可能出现吸附作用，导致回收率逐渐降低。经过筛选组合,发现选择100 mg PSA和50 mg C18作为吸附剂时,别嘌醇、丙磺舒和苯溴马隆的添加回收率分别为105.7%、98.9%和83.5%,符合GB/T 27404-2008标准对回收率范围的要求。

图 3 吸附剂对胶囊样品中3种药物回收率的影响Fig. 3 Effect of adsorbents on the recoveries of the three drugs in capsule samples PSA: primary secondary amine; GCB: graphitized carbon black.

2.4 基质效应的考察

基质效应会影响UPLC-MS/MS分析的准确性。常用来评价基质效应的方法为基质匹配标准曲线法,即基质匹配标准曲线与溶剂标准曲线的斜率之比,比值越接近1,则基质效应越小,比值在0.80～1.20之间时则认为基质效应可忽略不计[23]。在1.2.1节标准溶液的配制过程中,用空白基质溶液配制的混合标准工作液与含0.1%(v/v)氨水的乙腈溶液配制的混合标准工作液进行对比,考察3种药物在胶囊类保健食品中的基质效应(见表2)。结果显示,本方法的基质效应值在0.90～1.10之间,因此基质效应影响不大。

表 2 3种药物的线性范围、基质效应、回归方程、相关系数(R2)、检出限和定量限

y: peak area of quantitative ion pair;x: mass concentration, μg/L.

2.5 线性范围、检出限和定量限

为了进一步消除基质效应的影响,采用空白样品基质溶液配制不同浓度的混合标准溶液进行测定,以各组分定量离子的峰面积对相应组分的质量浓度进行线性回归计算,外标法定量。分别以S/N≥3和S/N≥10时的浓度作为方法的检出限和定量限。结果表明,3种药物在相应浓度范围内线性关系良好,相关系数均大于0.99;别嘌醇、丙磺舒和苯溴马隆的检出限分别为5、25和25 μg/kg,定量限分别为17、80和80 μg/kg(见表2)。与张秋炎等[15]采用HPLC-MS/MS测定保健食品中非法添加的9种尿酸调节类药物的方法相比,可以发现本方法中别嘌醇、丙磺舒的检出限更低,可能与采用QuEChERS降低了样品的基质效应、提高了方法灵敏度有关。

2.6 回收率与精密度

在胶囊类抗痛风保健食品中分别添加3种药物的混合标准工作液,按1.2.2节方法提取净化后测定,每个水平平行测试6次,计算3种药物的平均加标回收率及相对标准偏差(RSD)。结果表明,3种药物的平均加标回收率为76.8%～116.6%, RSD为2.7%～14.6%(见表3),均符合GB 27404-2008标准规定的回收率在60%～120%范围内、相对标准偏差不超过15%的要求。说明本方法具有良好的准确度和精密度。