一种新型极性脲丙基-C30固定相的制备和性能评价

卫 敏, 金小青, 赵岳星

(浙江师范大学化学与生命科学学院, 浙江 金华 321004)

高效液相色谱法(HPLC)因具有灵敏度高、分析速度快和专属性强等特点被广泛应用于食品、生物、药物检测等行业[1-4],其中大多数需检测的物质为强碱性和强极性化合物,在对该类化合物进行分离时,由于改性后的硅胶表面仍存在大量的残余硅羟基,碱性物质会在其上发生不可逆吸附,造成峰形拖尾现象[5]。经过不断探索,研究者发现,将极性基团嵌入到烷烃链上有助于减弱残余硅羟基对碱性化合物的影响[6-10],因此目前已有许多色谱工作者致力于该项研究。将各类极性基团嵌入到短链烷烃如C18上[11-15]，虽然在很大程度上改善了碱性物质的峰形,但该类固定相择形性差,限制了色谱柱的应用范围。色谱理论认为硅胶表面键合的烷烃碳链越长,固定相的择形性越好[16]。为使两者兼得,研究者将极性基团嵌入到碳链较长的烷烃上。张明亮等[17,18]将氨基酸甲酯这一极性基团成功嵌入到C30上,并通过实验证明该填料不仅可以对强碱性物质有很好的分离效果,还弥补了短链烷烃择形性差的缺陷。本研究旨在开发一种新型的极性填料,采用两步法将脲丙基嵌入到C30上,并对其做了一系列的物理性质表征与色谱性能研究。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Waters e2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司); Nicolet NEXUS670红外光谱仪(美国Thermo公司); JW-BK222型比表面及孔径分析仪(北京精微高博科学技术有限公司); Vario EL CUBE型元素分析仪(德国Elementar公司); OS20-S型电动搅拌机(北京大龙兴创实验仪器有限公司); ZNHW型电热套(巩义市予华仪器有限公司); MS-H-ProfT磁力加热搅拌器(北京星瑞通航科技有限公司); DSTV-150型装柱机(深圳市正大流体机电设备有限公司); YB-W400型移动式空压机(上海勇霸机电技术有限公司)。

硅胶(5 μm,苏州麦可旺志科技有限公司); 3-脲丙基三甲氧基硅烷、三十烷基三氯硅烷(上海迈瑞尔化学技术有限公司);盐酸、甲苯、三乙胺、甲醇、丙酮、四氢呋喃和氢氟酸(国药集团化学试剂有限公司)。所有试剂均为分析纯;色谱性能测试所用甲醇为色谱纯;水为德国Millipore Direct-Q3所制得的超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1极性脲丙基-C30(TPU-C30)固定相的制备

准确称取10 g硅胶和50 mL体积分数为20%的盐酸溶液,置于250 mL三口烧瓶中,加热搅拌回流24 h,抽滤,用超纯水洗涤,直至滤液为中性(用pH试纸测定),于100 ℃真空干燥12 h,制得酸化硅胶。

准确称取10 g上述酸化硅胶、55 mL甲苯和12 mL 3-脲丙基三甲氧基硅烷,置于250 mL三口烧瓶中,于110 ℃在N2气氛下加热搅拌回流24 h。反应完成后抽滤,依次用20 mL甲苯、20 mL丙酮、20 mL四氢呋喃和30 mL甲醇洗涤,于80 ℃真空干燥12 h,得到TPU。

准确称取5 g TPU、40 mL甲苯,置于250 mL三口烧瓶中,于110 ℃加热搅拌回流2 h,然后停止加热,向三口烧瓶中加入2滴氢氟酸和3 g三十烷基三氯硅烷,于110 ℃在N2气氛下加热搅拌回流24 h。反应完成后,抽滤,并依次用20 mL甲苯、丙酮、四氢呋喃和甲醇洗涤,于80 ℃真空干燥至恒重,即可制得TPU-C30。TPU-C30的制备路线见图1。

图 1 TPU-C30固定相的合成路线Fig. 1 Synthesis route of the polar urea-propyl-C30 (TPU-C30) stationary phase

1.2.2TPU-C30柱装填

采用匀浆法装柱,以环己醇-乙腈(1∶1, v/v)为匀浆剂,将3 g TPU-C30悬浮于其中制成匀浆液。以甲醇为顶替液,在高压下将TPU-C30填入不锈钢柱管(250 mm×4.6 mm)中,保持柱压为70 MPa,装柱时间约10 min。

1.2.3样品配制

甲苯标准溶液:准确量取170 μL甲苯,置于100 mL容量瓶中,用甲醇-水(75∶25, v/v)定容,冷藏。

极性与非极性物质混合标准溶液:准确称取1 mg尿嘧啶、40 mg苯酚、170 mg甲苯和5 mg 4-硝基氯苯,用甲醇-水(75∶25, v/v)溶解,定容于100 mL容量瓶中,冷藏。样品浓度:尿嘧啶0.01 g/L、苯酚0.4 g/L、甲苯1.7 g/L、4-硝基氯苯0.05 g/L。

苯并菲、邻三联苯、间三联苯、对三联苯混合标准溶液:准确称取2.5 mg苯并菲、7 mg邻三联苯、2.5 mg间三联苯和10 mg对三联苯,用甲醇溶解,定容于100 mL容量瓶中,冷藏。样品浓度:苯并菲0.025 g/L、邻三联苯0.07 g/L、间三联苯0.025 g/L、对三联苯0.1 g/L。

阿米替林标准溶液:准确称取2.5 mg阿米替林,用超纯水溶解,定容于10 mL容量瓶中,冷藏。样品浓度:0.25 g/L。

1.3 TPU-C30柱性能测试条件

1.3.1检出限

样品:甲苯标准溶液;色谱柱:C18柱(250 mm×4.6 mm)、C30柱(250 mm×4.6 mm)、TPU-C30柱(250 mm×4.6 mm);柱温:25 ℃;流动相:甲醇-水(75∶25, v/v);流速:1.0 mL/min;进样体积:10 μL;检测波长:254 nm。

1.3.2选择性

样品:极性与非极性物质混合标准溶液;色谱柱:TPU-C30柱和C30柱;柱温:25 ℃;流动相:水-甲醇(65∶35, v/v)(TPU-C30柱),水-甲醇(25∶75, v/v)(C30柱);流速:1.0 mL/min;进样体积:10 μL;检测波长:254 nm。

1.3.3择形性

样品:苯并菲、邻三联苯、间三联苯、对三联苯混合标准溶液;色谱柱:TPU-C30柱、C30柱和C18柱;柱温:25 ℃;流动相:水-甲醇=(20∶80, v/v);流速:1.0 mL/min;进样体积:10 μL;检测波长:254 nm。

1.3.4拖尾因子考察测试条件

样品:阿米替林标准溶液;色谱柱:TPU-C30柱和C30柱;柱温:25 ℃;流动相:水-甲醇(20∶80, v/v)(用20 mmol/L的KH2PO4与20 mmol/L的K2HPO4调节pH值至7);流速:1.0 mL/min;进样体积:2 μL;检测波长:254 nm。

2 结果与讨论

2.1 TPU-C30的设计

含有氮基团的配体有利于碱性物质的分离,受到大多数色谱研究者的青睐。脲丙基三甲氧基硅烷为含氮有机硅烷试剂,可与硅醇在硅胶表面发生共价反应,生成中间产物TPU。该反应稳定且键合量高。TPU继续与三十烷基三氯硅烷发生取代反应,即可得到TPU-C30。

TPU-C30固定相在分离极性与非极性物质混合标准溶液时,存在以下作用力:C30长链给予的疏水作用力以及脲基与某些溶质产生的π-π作用力。在分离碱性化合物时,理论上可能存在以下分离机理:(1)空间位阻效应,三十烷基分子较大,空间位阻大,可减小硅胶表面残余硅羟基与碱性化合物的接触;(2)静电屏蔽作用,含氮基团的固定相可与碱性溶质间形成较强的静电吸引力,屏蔽了硅羟基与碱性物质间的作用力,改善了峰形。

2.2 TPU-C30的结构表征

2.2.1扫描电子显微镜(SEM)表征

本研究对酸化硅胶和TPU-C30的外观形貌分别进行了SEM表征(见图2)。可以看出,键合反应前后硅胶的形貌无任何变化,均为规则的球状颗粒,且单分散性良好。表明TPU-C30具有良好的机械强度,适于色谱柱的装填,拥有良好的分离稳定性。

图 2 (a)酸化硅胶与(b)TPU-C30的SEM图Fig. 2 Scanning electron microscope (SEM) images of (a) acidified silica gel and (b) TPU-C30

图 3 酸化硅胶、TPU和TPU-C30的红外光谱图Fig. 3 Infrared spectra of acidified silica gel, TPU and TPU-C30

2.2.2红外光谱表征

红外光谱仪可对物质的分子结构和化学组成进行分析,为了鉴定所合成化合物的具体结构,分别对酸化硅胶、TPU与TPU-C30进行了红外光谱分析(见图3)。可以看出,在3 423.1 cm-1处的吸收峰为硅胶表面硅羟基伸缩振动峰信号;在1 101.1 cm-1和798.4 cm-1两处的吸收峰为Si-O伸缩振动带。TPU和TPU-C30均在2 927.5 cm-1左右出现了C-H伸缩振动吸收峰,表明硅胶表面含有机物,在约1 654.6 cm-1处出现了-NH振动峰。相较于TPU, TPU-C30的红外光谱图上的C-H振动吸收峰幅度更大,说明TPU-C30存在更多的有机成分。以上分析表明TPU-C30已成功合成。

2.2.3元素分析

元素分析能测定有机物中的元素种类,并可准确测定其相对含量。本研究采用元素分析技术分别对酸化硅胶与TPU-C30中所含N、C、H的相对含量进行了测定(见表1)。酸化硅胶的含碳量代表硅胶表面硅烷的键合程度。理论上色谱填料的含碳量应在2%～50%之间,经元素分析测定,TPU-C30的平均碳含量为13.76%,符合色谱填料的要求;N、C、H相对含量的相对偏差均小于5%,表明该填料制备工艺重复性良好。

图 5 酸化硅胶、TPU和TPU-C30的热重曲线图Fig. 5 Thermogravimetric (TG) curves of acidified silica gel, TPU and TPU-C30

%

2.2.4比表面与孔径分析

对TPU-C30进行比表面积与孔径分析测定。图4为TPU-C30的氮气吸脱附等温线与孔径分布图。氮气吸脱附等温线图中存在明显的滞后环,属于HI模型,表明TPU-C30为介孔材料。从孔径分布图可知,该材料孔径分布范围较窄,孔径均一,具有良好的色谱性能。测定结果表明,TPU-C30比表面积为114.434 m2/g,孔体积为0.378 cm3/g,孔径为7.466 nm。

图 4 TPU-C30的(a)氮气吸脱附等温线和(b)孔径分布图Fig. 4 (a) Nitrogen adsorption and desorption isotherm and (b) pore size distribution of TPU-C30

2.2.5热重分析

热重分析技术可在程序控制温度下测量物质的质量与温度间的关系。本研究分别对酸化硅胶、TPU与TPU-C30进行了热重分析(见图5)。可以看出,酸化硅胶、TPU与TPU-C30的热重曲线均在100 ℃前呈下降趋势,这是由于硅胶表面吸附的水分子蒸发导致的;TPU在200 ℃后呈下降趋势,在700 ℃时趋于平缓,在这一温度区间内汽化的基团为脲丙基。TPU-C30在200～450 ℃区间与TPU呈一致的下降趋势,表明其所汽化的有机成分也为脲丙基;在450 ℃后下降趋势加大,这是由于C30的沸点为460 ℃, C30与脲丙基同时汽化导致了这一现象。

2.3 TPU-C30柱使用寿命的考察

用300个柱体积(1.2 L)的甲醇冲洗制备的色谱柱,再用300个柱体积的甲醇-水(75∶25, v/v)冲洗制备的色谱柱。冲洗色谱柱前后,分别采用甲苯标准溶液对色谱柱进行稳定性测试。测试结果表明,甲苯在冲洗前后保留时间不变,柱效维持稳定,表明TPU-C30色谱柱具有良好的稳定性。

2.4 TPU-C30性能测试结果

2.4.1检出限考察

以甲苯标准溶液为溶质探针,在相同色谱条件下比较采用3种色谱柱(C18柱(250 mm×4.6 mm)、C30柱(250 mm×4.6 mm)和TPU-C30柱(250 mm×4.6 mm))时样品的检出限。结果表明,采用C18柱、C30柱和TPU-C30柱时,甲苯的检出限分别为1.08、0.61和0.17 mg/L。说明TPU-C30柱更有利于样品的检测与分析。

图 6 4种极性与非极性化合物在TPU-C30柱和 C30柱上的色谱图Fig. 6 Chromatograms of the four polar and non-polar compounds on the TPU-C30 column and C30 column

2.4.2选择性考察

以4种极性与非极性物质混合标准溶液为溶质探针,考察TPU-C30柱对极性不同的样品的选择性。结果表明,4种溶质在TPU-C30柱上实现了基线分离,并显示出不同于C30柱的选择性(见图6)。溶质在C30柱上的保留机理为疏水作用,按照其疏水性大小,溶质的保留时间顺序依次为尿嘧啶<苯酚<4-硝基氯苯<甲苯;采用TPU-C30柱时,疏水作用力占主导地位,但除此之外,固定相上还存在羰基、脲基,能与溶质分子形成较强的π-π作用力与氢键作用力,导致其选择性异于C30柱。

图 7 邻三联苯、间三联苯、对三联苯和苯并菲在C18柱、 C30和TPU-C30柱上的色谱图Fig. 7 Chromatograms of o-terphenyl, m-terphenyl, p-terphenyl and triphenylene on the C18, C30 and TPU-C30 columns α1/4: the ratio of the separation factor of triphenylene to o-terphenyl. Peak identifications: 1. o-terphenyl; 2. m-terphenyl; 3. p-terphenyl; 4. triphenylene.

2.4.3择形性考察

田中测试为常见的色谱固定相择形性测试方法,测试样品为苯并菲、邻三联苯、间三联苯与对三联苯,其物质结构大小(F)均为9,物质分子长与宽的比值(L/B)分别为1.12、1.11、1.47和2.34。苯并菲与邻三联苯的L/B值最为接近,分子平面却不同,本研究以两者之间的分离因子比值(α1/4)来衡量3种色谱柱(C18柱、C30柱和TPU-C30柱)的择形性。从图7中可以看出,间三联苯与苯并菲在C18柱上没有达到基线分离。采用C30柱时,4种芳香类化合物虽然实现了基线分离,但苯并菲与邻三联苯的α1/4较小,分析时间较长。这是由于C30相比于C18碳链较长,在疏水作用的基础上,与溶质分子之间还存在较大的空间位阻作用,不仅改变了4种溶质的出峰顺序,也在一定程度上增强了C30柱的择形性。而这4种芳香类化合物在TPU-C30柱上不仅实现了快速有效分离(保留时间小于13 min),而且其拥有比C30柱更大的α1/4值(2.67)。这是由于在TPU-C30柱中,固定相与溶质之间除了疏水作用力和空间位阻作用力外,带有苯环的溶质还与TPU-C30中的羰基发生了较强的π-π作用力。因此TPU-C30柱拥有优于C18柱和C30柱的择形性。

图 8 阿米替林在(a)TPU-C30柱和(b)C30柱上的色谱图Fig. 8 Chromatograms of amitriptyline on (a) TPU-C30 column and (b) C30 column

2.4.4拖尾因子考察

阿米替林为含氮有机碱,在pH=7时,二甲基胺与硅羟基均以离子状态存在,且此条件下两者之间的静电作用最强。因此采用阿米替林作为溶质探针,将流动相的pH值调节至7,评价TPU-C30柱的性能。结果表明,阿米替林在TPU-C30柱上无明显拖尾现象(见图8a),其拖尾因子为1.103;在C30柱上出现了较严重的拖尾现象(见图8b),拖尾因子达到了3.162。对碱性物质进行分析时,硅胶表面残余硅羟基的数量是造成拖尾的直接原因。C30柱固定相虽然通过封尾这一操作在一定程度上减少了硅胶表面残余硅羟基的数量,但由于存在空间位阻,其表面仍存在大量的硅羟基,使得阿米替林峰在C30柱上出现较严重的拖尾。而TPU-C30柱中存在脲基,在中性条件下,其解离出的N+与Si-O-存在较强的静电吸引力,屏蔽了硅羟基与阿米替林之间的作用力,改善了峰形。

3 结论

本文成功制备了TPU-C30固定相,具有机械强度高、热重稳定、孔径均一等优点。TPU-C30柱主要作用力为疏水作用,同时由于嵌入基团中含有羰基、氨基等多个作用位点,还存在π-π电荷转移作用力及氢键作用力。多种作用力与适当的疏水性共同作用,使TPU-C30柱在分离极性不同的物质时显示出不同的选择性;在分离同分异构体时有更优的择形性;在分离碱性物质时峰形改善明显。TPU-C30柱在一定程度上弥补了传统C18柱与C30柱的不足,具有较大的应用空间。