超微粉碎对红花籽粕蛋白质形态和理化功能性的影响

张爱琴，孙乾，李芳，罗丰收，孔令明*

1(新疆农业大学 食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐，830052) 2(新疆轻工职业技术学院，新疆 乌鲁木齐，830021)

红花(CarthamustinctoriusL.)，别名红蓝花、刺红花。红花籽中亚油酸的含量相对较高，具有活血化瘀、止痛的功效。红花籽粕即为红花籽经一系列榨油方式之后的弃物，油料在生产加工中会产生剩余的饼粕，而这些籽粕中富含25%～35%的蛋白质，脱脂后的籽粕蛋白含量更是高达45%，且红花籽蛋白的溶解、乳化和起泡性均良好，为营养均衡的优质蛋白。在这些优质蛋白中，18种氨基酸都较为齐全，占到人体必需氨基酸的30%以上[1]。目前，大量的植物饼粕被用作动物饲料，或者被直接填埋抛弃，对榨油后饼粕中含有丰富的蛋白质利用率很低，这不仅造成了资源浪费，也给环境造成了极大的危害。

粉碎技术是食品生产加工过程中不可或缺的一部分，也是21世纪一种新型的加工技术，运用物理手段对食品进行一定超微粉碎处理，可以把3 mm以上的物质粉碎至10～25 μm，并且具有快速、低温、粒度小、分布均、省原料、利用率高等优点，可以增大物质的表面积，使物质具有较好的分散性、溶解性，并对营养成分破坏较小。超微粉碎技术在食品加工中已被广泛应用，不仅可提高食品的口感，更可促进物质的利用率。

通过对红花籽的超微粉碎，可以得到在形态上受到了一定改变的红花籽粕蛋白，相比普通方式处理的红花籽粕具有更好的流动性，且在蛋白的功能特性上有良好的改善。对红花籽粕蛋白的深入性研究，不仅可以加强对植物蛋白的综合性利用，也为植物性蛋白的基础性研究提供了相关的实践依据[2]，更为油料饼粕有效利用提供技术支撑。

1 试验材料和设备

1.1 材料与试剂

红花籽粕，新疆庄子公司提供；花生油，超市购买。

牛血清白蛋白(南京比迪生物)，甘氨酸(河北顺博化工产品有限公司)，低分子质量蛋白质MarkerⅠ、α-巯基乙醇、Tris碱、双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠、过硫酸铵、四甲基乙二胺、AM(电泳级)，以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JY600电泳仪，上海圣科仪器设备有限公司；MV-IIA双垂直板电泳槽，郑州卓鑫仪器有限公司；BSD-WX1350脱色摇床，新疆伊犁州数显脱色摇床生产厂；EM-30 Plus型扫描电镜，韩国COXEM公司；DV-3T粉体流变仪，山东实验室仪器有限公司；400Y超微粉碎机，铂欧五金厂；，FW80高速万能粉碎机，北京诺诚嘉信仪器有限公司；SZG-01真空冷冻干燥机，无锡市精诚粉体有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白质分子质量的测定

变性梯度凝胶电脉(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel delctrophoresis, SDS-PAGE)是目前较为通用的测定蛋白质的方法之一，原理是利用蛋白质分子中亚基分子量的区别性，对其进行一定的离子型外力作用，导致亚基移动被改变，从而得到定向分离。因其具有较高的分辨率和较好的重复性被广泛地运用[3]。

1.3.2 蛋白质微观形态的观测

(1)称取红花籽粕1 g，干燥、粉碎、过筛[4]。

(2)将筛后的红花籽粕以料液比1∶10(g∶mL)形成溶液，并用0.1 mol/L的NaOH调pH值至8.0。在温度50 ℃，时间60 min下，对红花籽粕蛋白进行碱提。上离心机4 800 r/min，15 min，测定上清液体积，并转移到1 000 mL定容瓶中定容[5]。

(3)用蒸馏水将其洗至中性并去除多余水分，浓缩后进行真空冷冻干燥。将冷冻干燥机处理过的红花籽粕蛋白样品经超微粉碎和普通粉碎2种方式加以处理，运用扫描电子显微镜(SEM)进行微观结构观测和分析[6]。

1.3.3 蛋白粉物理性测定

用蒸馏水将其洗至中性，将冷冻干燥机处理过的红花籽粕蛋白样品经超微粉碎和普通粉碎2种方式加以处理。

(1)将预处理后的样品放入石英杯中密闭保存备用。

(2)取待测样品放入粉体流变仪中。流变仪的测定一般分为初搅拌和正式搅拌2个步骤：初搅拌使红花籽粕蛋白的粉体样品在石英杯中的分布较为匀称；第二阶段的正式搅拌时，搅拌器分别以15、30、45和60 mm/s的速度进行2次加压搅拌。

(3)测定红花籽粕的结块性、黏着性和流动性[7]。

1.3.4 蛋白粉功能性测定

1.3.4.1 乳化及乳化稳定性的测定

(2)称取40 mL蛋白溶液样品，加40 mL花生油；使用均质机做均质处理。

(3)将蛋白溶液于4 000 r/min离心15 min，测定其乳状液的乳化层高度(h1)和总液体高度(h)。乳化性计算公式为[8-9]：

(1)

(4)使用水浴锅在85 ℃水浴下，对离心后的混合液做30 min的保温处理，冷却至室温后，测定其乳状液的乳化层高度(h1)并记录30 min后的乳化层高度(h2),乳化稳定性计算公式为[10]：

(2)

1.3.4.2 起泡及起泡稳定性的测定

转染48 h后，MTT检测各组SHG-44细胞增殖水平，结果显示，miR-543 mimic组与mimic NC组相比细胞增殖水平明显降低(P＜0.01)，miR-543 inhibitor组与inhibitor NC组相比细胞增殖水平明显升高(P＜0.01)，见图2;由此可见miR-543过表达可抑制SHG-44细胞增殖，抑制miR-543的表达可促进SHG-44细胞增殖。

(1)取1 g红花籽粕蛋白,加100 mL蒸馏水进行溶解，调pH至7.0，并在100～600 W超声功率下处理15 min。

(2)将样品均质3 min，快速记录均质停止时泡沫的体积(V1)和液体总体积(V0)，起泡性计算公式为[11]：

(3)

(3)测定起泡性后，放置于室温下充分静置30 min，再次测定泡沫体积(V2)[11]。泡沫稳定性计算公式为[12-13]：

(4)

1.3.4.3 红花籽粕蛋白质溶解度的测定

(1)取1 g红花籽粕蛋白，加100 mL蒸馏水进行溶解，调pH值至7.0，并在100～600 W超声功率下处理15 min；

(2)离心机4 000 r/min离心15 min，取上清液；

(3)用考马斯亮蓝的方法检测所取的上清液中蛋白质的含量，按公式(5)计算溶解度[14-15]：

(5)

式中：ρ,蛋白质的质量浓度,g/mL；V,溶液体积,mL；m,样品蛋白质质量,g。

1.4 数据处理

测量数据采用PG Flash软件可将自定义的测量程序下载到仪器上实现自动化操作，且仪器自带RheocalcT软件，并结合Excel 2003对数据进行采集和分析。数据进行3次重复试验，取平均值。

2 结果与分析

2.1 SDS-PAGE的测定和分析

红花籽粕蛋白是由20%～25%的清蛋白、50%球蛋白的活性蛋白与1%～4%的醇溶蛋白、20%～25%谷蛋白的贮藏蛋白构成，成分相对比较复杂[16-17]。

1-普通粉碎；2-超微粉碎

图1 红花籽粕蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图

Fig.1 SDS-PAGE gel electrophoresis of safflower seed meal protein

由图1可以看出，大部分的红花籽粕蛋白质量分布于20～45 kDa之间，这种分布在一定程度上可以说明其所含的蛋白较为集中；且分子质量均在66.2 kDa以下，主要以小分子构成，这种相对比较集中的成分便于在蛋白的功能特性、改性上加以综合利用。

2.2 不同粉碎处理对蛋白微观形态变化的影响

由图2可以看出，经扫描电镜(SEM)扫描后，普通粉碎处理的蛋白结构相比超微粉碎处理的蛋白结构具有更大的比表面积和较大的团聚块状结构；而经超微粉碎处理的蛋白则显得更加细小化、分散化，颗粒呈现出无序的不规则形，颗粒大小较为匀称，颗粒之间的空隙明显加大。这也说明，经超微粉碎处理后的蛋白具有更加良好的分散性[18]。

a-普通粉碎;b-超微粉碎

图2 不同粉碎处理后红花籽粕蛋白的微观形态

Fig.2 Microstructure of safflower seed meal protein after different smashing treatments

2.3 不同粉碎处理对蛋白结块性、黏着性以及流动性的影响

2.3.1 不同粉碎处理对蛋白结块性的影响

在食品加工过程中，超微粉碎技术使得蛋白粉末的结块现象较为严重，甚至会影响食品的品质，但可使食品咀嚼感及营养吸收率提高[19]。这种现象，也有可能是因为在试验操作中，超微粉碎要比一般粉碎更容易吸收空气中的水分所导致。

由图3可以得知，通过普通粉碎与超微粉碎的相对比，经超微粉碎出现的结块强度是普通粉碎结块强度的2.5倍，而超微粉碎技术的结块平均强度高达178.673，是普通粉碎的近2倍。超微粉碎可以增大蛋白质的接触面积，从而使得蛋白质分子间的作用力变大，而这种作用力的增大，可以间接影响蛋白粉的休止角、堆积密度等特性，在一定程度上改变蛋白质粉在实际生产中的性状[20-21]。

a-普通粉碎;b-超微粉碎

图3 红花籽蛋白质在不同粉碎处理下的结块性示意图

Fig.3 The caking of safflower protein under different comminution

2.3.2 不同粉碎处理对蛋白粘着性的影响

由图4可以得知，经超微粉碎后的蛋白，分子间的内聚力为16.962，可以看出其具有较大的黏性。而经普通粉碎的蛋白，其分子间的内聚力仅为11.643，黏性小。一方面是因为红花籽粕蛋白质粉末在超微粉碎的处理下可以增大蛋白质的可塑性和黏性，蛋白质在超微粉碎处理下，接触面增大导致蛋白质颗粒间的摩擦力增大，分子间作用力增强[22]。

2.3.3 不同粉碎处理对蛋白流动性的影响

粉体的流动系数比值越接近系数1，则说明粉体在动态流动性上更趋于一种稳态，这使得粉体的产品质构更加稳定，更加不宜被压缩，也更不易被分层，流变性能更好[23]。经仪器测定和数据分析可以得出(见图5)，经超微粉碎后的蛋白粉末流动性是普通粉碎的1.06倍，相比超微粉碎，普通粉碎接近于1.00的流动性显得更具有一定优势性。

a-普通粉碎;b-超微粉碎

图4 红花籽粕蛋白质在不同粉碎处理下的粘着性示意图

Fig.4 Illustration of adhesion of safflower seed meal to different comminution treatments

a-普通粉碎;b-超微粉碎

图5 红花籽粕蛋白质在不同粉碎处理下的流动性示意图

Fig.5 Schematic diagram of fluidity of safflower seed meal under different comminution treatment

这可能是因为超微粉碎过于细微，改变了分子间的静电荷，使得静电荷中相互排斥性增大，导致分子间作用力加大，因此使得其流动性减小。

2.4 不同粉碎处理对蛋白功能特性的影响

根据蛋白质功能性质的分类，分别考察了蛋白的溶解性、乳化性以及起泡性在不同破碎处理条件下的变化，结果如图6所示。红花籽粕蛋白粉在超微粉碎处理后和普通粉碎处理后的相比较中，在功能特性上(溶解度、乳化性和起泡性)都得到了较好的改善。经超微粉碎处理的红花籽粕比普通粉碎处理的红花籽在溶解性、乳化性和起泡性上分别提高了56.83%、41.60%和36.53%。各项功能性指标的提升可能是因为超微粉碎的强物理性导致了大分子物质转变为更多的小分子物质，而蛋白质的高级结构也相对发生了一定的变化。超微粉碎技术可让蛋白质的空间结构发生变化，从而使得变性折叠的蛋白质再次延展，因为蛋白质的颗粒变得越来越细小而接触面增大了，使得蛋白质功能特性得以恢复。

图6 不同破碎处理对红花籽粕的功能特性的影响

Fig.6 The functional properties of safflower seed meal are affected by different crushing treatments

因此，超微粉碎技术对于红花籽粕蛋白功能特性的改善具有较好的作用，尤其是在提高蛋白的溶解性上。这一点使得该技术在食品工业上的适用范围更加广泛，对于在其他领域的应用，也提供了更多的可行性。

3 结论

(1)红花籽粕蛋白的成分较为复杂，分子质量一般分布在10.5～66 kDa，但是营养成分分布较为均衡。超微粉碎后，蛋白质颗粒的表面积增大，易溶于水，且经过电镜扫描显示，蛋白质颗粒破碎的大小已达到纳米级，这使得营养物质更加有利于吸收。

(2)在经过超微粉碎处理后，红花籽粕蛋白的颗粒大小匀称，蛋白的孔隙率和表面能增大，紧密的组织结构被破坏。通过质构流变仪的测定可知，超微粉碎与普通破碎相比，红花籽粕蛋白质的颗粒流动性不会发生较大变化。

(3)超微粉碎与普通粉碎相比，红花籽粕蛋白的流变性和功能性都有了一定的变化，分子内部以及分子间的结合力逐渐消失，超微粉碎的结块强度是普通粉碎结块强度的2.5倍，而超微粉碎技术的结块平均强度高达178.673，是普通粉碎的近2倍。这种强烈的物理因素导致了一定的物理改性效果。

(4)通过对红花籽粕超微粉碎和普通粉碎2种方式的对比，并测定和分析其物理性和功能性，可以得出在超微粉碎处理下，红花籽粕蛋白粉末的物理性和功能特性都有了明显的改善。经超微粉碎处理的红花籽粕比普通粉碎处理的红花籽在溶解性、乳化性和起泡性上分别提高了56.83%、41.60%和36.53%。超微粉碎不仅一定程度上增大了物料的表面积，还使得其具有良好的分散性、溶解性等，这相对可以提高食品的口感，更加适于人体的消化和吸收，提高了产品的转化利用率。