黑曲霉内切β-1,4-半乳聚糖酶AghA的分子克隆与特征解析

蔡可，王太康，王君，董自星，田康明，金鹏，刘晓光，王正祥,

1(天津科技大学 生物工程学院，天津，300457) 2(天津科技大学 化工与材料学院，天津，300457)

低聚半乳糖(galactooligosaccharides，GOS)是由0～6个半乳糖连接到乳糖分子的半乳糖基一侧形成的一种杂低聚糖，即Gal-(Gal)n-Glc/Gal(n为0～6)。在自然界中，GOS主要存在于动物乳汁中，人类母乳中的GOS含量较多[1]。因其具有热值低,促进双歧杆菌增殖,低龋齿性,防止便秘,改善脂质代谢以及提高免疫力等生理功能，被广泛应用于食品、医药等行业[1-2]。GOS的制备方法主要有：从天然原料中提取、化学合成法、直接发酵法和酶法合成等[2]。其中，酶法合成具有反应条件温和、操作简单和效率高等优点，是目前工业生产上最常用的方法[3]。它主要是以乳清或乳糖为底物，利用β-半乳糖苷酶催化合成GOS。然而，由于β-半乳糖苷酶同时具有水解活性和转苷活性，反应后期随着底物浓度的降低，酶的水解活性更加突出，从而将合成的GOS二次水解，导致GOS的收率较低，这是GOS酶法制备中面临的主要问题[4]。

内切β-1,4-半乳聚糖酶(endo-β-1,4-galactanase，EC 3.2.1.89)属于糖苷水解酶第53(GH53)家族，可以特异性地水解β-1,4-半乳聚糖和鼠李半乳糖醛酸聚糖I(简称RGI，来源于非木本植物细胞壁中的果胶)中的β-1,4糖苷键产生低聚半乳糖[5-6]。此外，它在木质纤维素的生物转化[6]、果汁和葡萄酒加工、动物饲料的改良、洗涤剂、纺织和造纸等行业也有广泛的应用[7-8]。目前，国外学者对内切β-1,4-半乳聚糖酶做了大量研究，包括分离纯化、异源表达、酶学性质研究、三维结构解析和分子改造等，国内目前尚未见相关研究。已报道的内切β-1,4-半乳聚糖酶主要来源于细菌和丝状真菌，其中大部分属于青霉和曲霉属[9]。

该研究拟采用分子克隆技术，将黑曲霉CICIM F0510中的内切β-1,4-半乳聚糖酶基因在毕赤酵母中进行克隆表达，进行初步纯化后，系统解析其生化特征，并初步探讨其水解土豆浆制备低聚半乳糖的可行性，为该酶在低聚半乳糖制备行业中的应用提供材料和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒和培养条件

黑曲霉CICIM F0510[10]和大肠杆菌JM109为本实验室保存菌株。毕赤酵母GS115及表达质粒pPIC9K购自Invitrogen公司。重组毕赤酵母GS115 (pPIC-aghA)研究中构建、筛选和保藏。黑曲霉和大肠杆菌分别采用PDA和LB培养基进行培养；毕赤酵母所用培养基MD、YPD、BMGY和BMMY等按照Invitrogen公司的Pichia Expression Kit进行配制。

1.1.2 主要试剂

PyrobestTMDNA聚合酶和蛋白分子量标准，美国Thermo公司产品；RNA抽提试剂盒(High Pure RNA Isolation Kit)和cDNA合成试剂盒(Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit)，Roche公司产品；无氨基酵母氮源、胰蛋白胨和酵母抽提物，英国OXOID公司提供；半乳聚糖(galactan(potato)),爱尔兰Megazyme公司；色谱纯乙腈和薄层层析硅胶板分别由生工生物工程(上海)股份有限公司和烟台德信生物科技有限公司提供；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 重组毕赤酵母的构建

1.2.2 内切β-1,4-半乳聚糖酶的异源表达及分离纯化

将重组毕赤酵母GS115(pPIC-aghA)的单菌落接种到25 mL YPD液体培养基中，于30 ℃、200 r/min培养至OD600值为2.0～6.0(约16～18 h)。然后按体积分数为1%的接种量接入25 mL BMGY培养基中，30 ℃、200 r/min培养至对数生长期。再离心(4 ℃，5 000 r/min)5 min回收酵母细胞，并将其重悬于50 mL BMMY培养基中，使其OD600值为1.0，于30 ℃、200 r/min继续培养。每隔24 h补加无水甲醇至终体积分数为0.5%，以维持诱导，并同时取样进行酶活测定，直至酶活不再增加。发酵结束后，12 000 r/min离心10 min收集发酵液，即为粗酶液。

将粗酶液用饱和度分别为30%和90%的硫酸铵进行分级沉淀，再通过PD-10脱盐柱去除盐离子。最后，采用凝胶柱Superdex 75 10/300 GL对其进行纯化，并通过酶活测定和SDS-PAGE分析重组酶的纯化情况。其中，SDS-PAGE按照文献[12]进行，浓缩胶和分离胶的浓度分别为5%和12%。

1.2.3 重组β-1,4-半乳聚糖酶的酶学特征解析

1.2.3.1 重组β-1,4-半乳聚糖酶的酶活测定

按照文献方法[6]，在反应体系中加入用100 mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4.5)配制的5 mg/mL半乳聚糖溶液和0.1 mL经适当稀释的酶液(对照组为沸水灭活的酶液)。振荡混匀后，于45 ℃下反应10 min。然后加入1 mL 3,5-二硝基水杨酸(DNS)溶液，100 ℃下煮沸10 min。最后，测定反应液在540 nm下的吸光值，并根据半乳糖标准曲线计算酶活力。在上述条件下，1 min内产生对应于1 mgD-半乳糖的还原力所需的酶量为1个酶活力单位(U)。

采用BCA试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)测定蛋白浓度，以牛血清白蛋白V部分为标准参照。

1.2.3.2 重组酶的最适反应温度及热稳定性测定

将纯化后的酶液进行适当稀释，然后分别在30、35、40、45、50、55、60、65、70和80 ℃下进行反应。再按照1.2.3.1的方法进行酶活测定，以酶活最高者为100%，计算各温度下的相对酶活力，以确定重组酶的最适反应温度。将纯化后的酶液进行适当稀释，分别在30、40、50、60、70和80 ℃下保温2 h，每隔30 min取样，在冰上放置10 min后测定酶活力，以未进行热处理酶液的酶活力为100%，计算相对酶活，确定重组β-1,4-半乳聚糖酶的热稳定性。

1.2.3.3 酶的最适反应pH值及pH稳定性测定

在不同pH值(pH 3.0～8.0)，以溶于相应pH值的缓冲液的0.5 mg/mL半乳聚糖为底物进行反应，然后按照1.2.3.1的方法测定酶活。以酶活最高者为100%，计算相对酶活，从而确定重组半乳聚糖酶的最适作用pH值。将纯化后的酶液分别用不同pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0)的缓冲液进行适当稀释后，再于相应pH值的缓冲液中孵育(温度为40 ℃)1 h后测定酶活。以酶活最高者为100%，计算残余酶活力，确定酶的pH稳定性。所用缓冲液为0.1 mol/L醋酸和0.2 mol/L醋酸钠缓冲液。

1.2.3.4 金属离子或化学试剂对酶活的影响

在重组酶与其底物进行反应的体系中加入金属离子Ca2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Hg2+和Fe3+，使其终浓度为1 mmol/L，在最适作用温度和pH值下测定重组酶的酶活，以未加金属离子的反应体系的酶活为100%，计算相对酶活力。

1.2.3.5 动力学参数的测定

分别以0.02、0.025、0.03、0.035、0.04和0.05 mg/mL的半乳聚糖为底物，在重组半乳聚糖酶的最适反应温度和pH值条件下进行反应，按照1.2.3.1的方法测定酶活。然后以1/V对1/S作图，根据双倒数法计算米氏常数Km及最大反应速度Vmax。

1.2.4 重组酶水解土豆的产物分析

利用打浆机将土豆打碎，成为糊状。再利用G3砂芯漏斗对处理后的土豆浆进行反复清洗，并采用DNS法检测滤出液中的残糖，直至滤出液中无残糖存在，清洗完毕。在1 mL酶促反应体系中加入300 g/L上述预处理的土豆浆和10 U/mL酶液。在45 ℃、pH值4.5下反应2 h后，沸水浴10 min灭酶。再于13 000 r/min离心10 min，取上清。适当稀释后，用0.22 μm滤膜过滤，再利用高效液相色谱检测过滤液中的产物组成。

在1 mL酶促反应体系中，加入300 g/L预处理的土豆浆和10 U/mL酶液，于pH值4.5和45 ℃进行反应。分别在反应15、30、60、120和180 min时取样，于100 ℃煮沸10 min灭酶。离心取上清后，采用高效液相色谱法分析每种组分含量随着时间的变化情况。

色谱条件：色谱柱为GRACE Prevail Carbohydrate ES 5u (250 mm×4.6 mm；5 μm)；流动相为V(乙腈)∶V(水)=60∶40；流速：1.0 mL/min；进样量：5 μL，柱温：30 ℃。检测器：蒸发光散射检测器；检测条件：漂移管温度90 ℃，空气载气流速2.2 L/min，增益为1。

2 结果与分析

2.1 β-1,4-半乳聚糖酶基因的克隆表达与分离纯化

2.1.1 内切β-1,4-半乳聚糖酶基因的异源表达

以黑曲霉CICIM F0510的cDNA为模板，利用引物AghA1和AghA2对其内切β-1,4-半乳聚糖酶基因aghA进行PCR扩增。PCR产物经XbaⅠ酶切后，与经过SnaB Ⅰ和AvrⅡ酶切的质粒pPIC9K连接，获得重组表达质粒pPIC-aghA。DNA测序的结果表明，所克隆的aghA基因具有完整的开放阅读框，且其序列与A.nigerCBS 513.88基因组公布的序列完全一致。其大小为1 065 bp，编码354个氨基酸残基。进一步将重组质粒用SacI线性化后，电转化入毕赤酵母中，获得重组菌GS115 (pPIC-aghA)。在250 mL三角瓶培养条件下，发酵进行到120 h时，重组菌的内切半乳聚糖酶活性达到最大，为130 U/mL。

2.1.2 重组β-1,4-半乳聚糖酶的分离纯化

进一步采用盐析、脱盐和凝胶过滤层析法将重组β-1,4-半乳聚糖酶进行纯化，各步骤的纯化倍数和回收率如表1所示。

表1 重组半乳聚糖酶AghA的分离纯化

纯化后，AghA的比酶活为14 881.09 U/mg，是纯化前的49.4倍，回收率约为16.79%。SDS-PAGE分析结果表明，重组酶AghA的分子质量约为42.0 ku(图1)，略高于其理论分子质量(37.0 ku)，可能是该酶已经被糖基化修饰了。通过在线软件ISOGlyP(http://isoglyp.utep.edu/)预测可知，AghA含有2个糖基化位点。此外，重组酶的纯度基本满足生化特征分析的要求。

2.2 重组β-1,4-半乳聚糖酶酶学性质的解析

1-粗酶液；2-盐析和脱盐后的AghA；3-凝胶过滤层析后的AghA；M-蛋白分子量标准

图1 SDS-PAGE分析重组酶AghA的纯化情况

Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purification of recombinant enzyme AghA

2.2.1 最适反应pH值和pH稳定性

分别在不同pH(3.0～8.0)条件下测定重组酶AghA的酶活，结果如图2-a所示。重组酶AghA的最适作用pH值为4.5，它在较宽泛的pH值范围内(3.0～5.5)的相对酶活保持在80%以上。AghA还具有良好的pH值稳定性，在pH 4.0～6.0的缓冲液和40 ℃孵育1 h后，残余酶活力仍能保持80%以上(图2-b)。

a-最适反应pH;b-pH稳定性

图2 重组半乳聚糖酶AghA的最适反应pH及pH稳定性

Fig.2 The pH optimum and pH stability of recombinant galactanase AghA

2.2.2 最适作用温度和热稳定性

分别将重组酶AghA在不同温度(30～80 ℃)和pH 4.5条件下进行反应，然后按照1.2.3.1的方法测定酶活，结果如图3-a所示。

a-最适作用温度;b-热稳定性

图3 重组半乳聚糖酶AghA的最适作用温度及热稳定性

Fig.3 The temperature optimum and thermostability of recombinant galactanase AghA

由图3可知，重组酶AghA的最适反应温度为45 ℃，在35～50 ℃范围内，其相对酶活在80%以上；而当反应温度超过60 ℃以后，酶活力显著下降。热稳定性的研究表明，重组酶AghA在30～50 ℃的稳定性较好，孵育2 h后，其残留酶活仍在60%左右(图3-b)；在60 ℃和70 ℃保温1 h后，该酶的残余酶活力分别为40%和20%左右；而在这2个温度下孵育2 h后，重组酶AghA只能保持20%和10%左右的相对酶活。

2.2.3 金属离子或化学试剂对AghA酶活的影响

分别在AghA与其底物进行反应的体系中添加不同的金属离子或化学试剂，使其终浓度为1 mmol/L，以研究它们对AghA酶活的影响，结果见表2。由表2可知，大部分金属离子对内切β-1,4-半乳聚糖酶AghA的酶活没有显著影响，这使其更适用于工业应用过程中[13]。此外，EDTA也对该半乳聚糖酶的酶活没有显著影响，这与其他报道一致[6, 14]。Zn2+和Co2+对该酶的活性有轻微的抑制作用；Fe3+对AghA有强烈的抑制作用；而Hg2+可使AghA几乎完全失去活性。

表2 金属离子或化学试剂对AghA酶活的影响

2.2.4 动力学参数的测定

以不同质量浓度(0.02～0.05 mg/mL)的半乳聚糖为底物，在重组酶AghA的最适作用pH值和温度下反应，然后按照1.2.3.1的方法测定酶活。采用双倒数作图法，绘制重组酶AghA水解半乳聚糖的动力学曲线，求得该酶对半乳聚糖的最大反应速率Vmax和米氏常数Km分别为400 mg/(mL·min)和0.08 mg/mL。该Km值远小于Bacilluslicheniformis[6]、Emericellanidulans[13]以及Penicilliumcitrinum[15]来源内切β-1,4-半乳聚糖酶的Km值(分别为2.3 mg/mL、0.51 mg/mL和0.055%)。可见，重组酶AghA对半乳聚糖具有较强的亲和性。

2.3 重组酶对土豆中半乳聚糖的水解作用

2.3.1 土豆浆酶解产物的HPLC分析

以300 g/L预处理后的土豆浆为底物，在45 ℃、pH值4.5下准确反应2 h后取样，采用HPLC对酶解产物进行分析，结果如图4所示。重组半乳聚糖酶AghA将土豆水解后，其产物主要是半乳糖、半乳二糖和半乳三糖，还有极少量的半乳四糖。

G1-半乳糖；G2-半乳二糖；G3-半乳三糖

图4 半乳聚糖酶AghA作用于土豆浆的产物分析

Fig.4 HPLC profiles of potato pulp hydrolyzed by recombinant galactanase AghA

2.3.2 重组酶AghA水解土豆浆的反应进程

将重组酶AghA与300 g/L预处理的土豆浆在pH值4.5和45 ℃下进行反应。并于不同的时间取样，采用HPLC测定每种组分含量随着时间的变化情况。以反应时间为横坐标，每种组分的含量为纵坐标绘制曲线，结果如图5所示。反应初始阶段，内切-β-1,4-半乳聚糖酶AghA水解土豆浆生成半乳三糖、半乳二糖和半乳糖；反应15 min后，半乳三糖的含量不断减少，而半乳二糖和半乳糖的含量则不断地增加。而反应进行到180 min时，半乳三糖的相对含量仅为0.38 mg/mL，反应的最终产物主要是半乳糖和半乳二糖，二者的质量浓度分别为5.94和4.03 mg/mL。

图5 重组酶AghA水解土豆浆的反应进程

Fig.5 Hydrolysis of potato pulp by recombinant enzyme AghA

3 讨论

该研究采用分子克隆与遗传重组技术成功将黑曲霉CICIM F0510来源的内切β-1,4-半乳聚糖酶基因在毕赤酵母中进行了异源表达。摇瓶培养条件下，重组酶AghA的总酶活和比酶活分别为130 U/mL和301.23 U/mg(表1)，高于大多数已报道的内切β-1,4-半乳聚糖酶的酶活，比如B.licheniformis[6]、E.nidulans[13]、P.chrysogenum[16]、P.citrinum[15]和Thermotogamaritima[17]来源内切β-1,4-半乳聚糖酶的酶活分别为127 U/mg、109 U/mL、0.127 U/mL、48.96 U/mg和21.8 U/mg，具有潜在的工业化前景。

酶学性质的研究表明，重组内切半乳聚糖酶AghA的最适反应温度和pH值分别为45 ℃和4.5，且在30～50 ℃或pH值4.0～6.0具有较好的稳定性(图2和图3)，这与低聚半乳糖的制备条件(30～50 ℃；pH 5.6～7.0)[2]比较吻合，适用于GOS的制备过程。此外，它与B.licheniformis[6]、E.nidulans[13]、P.chrysogenum[16]、A.aculeatus[18]以及Talaromycesstipitatus[19]等来源内切半乳聚糖酶的最适反应温度和pH值相似。但其最适反应温度和热稳定性却低于嗜热微生物来源的内切β-1,4-半乳聚糖酶[17, 20]。后续可以进一步通过分子改造来提高其热稳定性，以适应不同的工业需求[19]。

土豆浆是土豆淀粉生产行业的副产物，具有价格低、产量大等特点。它主要是由土豆的细胞壁组成，含有大量的果胶，特别是鼠李半乳糖醛酸聚糖I(RGI)和同型半乳糖醛酸聚糖(HG)[21]。其中，RGI的侧链主要含有以β-1,4糖苷键连接的半乳聚糖。该研究利用重组酶AghA水解土豆浆，可以释放半乳二糖、半乳三糖和半乳四糖等低分子量的半乳聚糖(图4)；且随着反应时间的延长，半乳三糖被不断水解成半乳二糖和半乳糖(图5)，这与其他真菌内切β-1,4半乳聚糖酶的作用特征相似。而细菌来源的半乳聚糖酶则优先作用于高分子量半乳聚糖，且水解产生的低聚半乳糖的聚合度≥4[22-23]，这是由于它们的底物结合凹槽的结构不同造成的[5, 24]。此外，由于内切β-1,4半乳聚糖酶只具有水解作用，通过条件控制应该不会产生GOS的二次水解，有望解决产品回收率低的问题。

综上所述，该研究成功将黑曲霉CICIM F0510来源的内切β-1,4半乳聚糖酶在毕赤酵母中进行了克隆表达和酶学特征解析。重组半乳聚糖酶AghA较高的表达量、良好的酶学性质以及对土豆浆的水解作用，为其工业化生产以及在低聚半乳糖制备中的应用奠定了坚实的基础。