采用RT-PCR方法诊断猪繁殖与呼吸综合征

吕娜娜 （山东畜牧兽医职业学院宠物科技系 山东 潍坊 261061）



采用RT-PCR方法诊断猪繁殖与呼吸综合征

吕娜娜 （山东畜牧兽医职业学院宠物科技系 山东 潍坊 261061）

山东某猪场发生以猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)为主要特征的疾病。笔者对送检的病料进行了实验室诊断：剖检主要发现肺水肿，出血；组织病理学检测主要发现肺间质明显增宽，肾小管上皮肿胀；采用RT-PCR检测方法检测猪肺脏组织，结果被验样品在400bp扩增带为PRRSV阳性，阴性对照无扩增带出现。诊断结果表明：该猪场发生的病例为猪繁殖呼吸障碍综合征。

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，俗称蓝耳病，由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种有高度传染性的猪综合征。目前根据基因序列和抗原特性的不同，PRRSV可划分为I型(原欧洲型，代表毒株为Lelystad virus株)和II型(原美洲型，代表毒株为ATCCVR-2332株)。1987年最早发现于美国(Zeman等，1993)，1994~1995年从美国引种传入我国。1996年我国郭宝清等第一次分离出该病毒(郭宝清等，1996)。2001~2002年发生跨省区流行；由南向北扩散、蔓延、由华东、华南、华北、东北等10个省市(县) 发病。2006年5月下旬起，以高热病为特征的蓝耳病，首先在南方省市发病，同年11月至12 月延伸到东北地区，全国共有19个省市(县)出现疫情(林荣泉，2007)。2008年，我国将高致病性蓝耳病列为一类动物疫病，并进行强制免疫。在自然流行中，PRRS仅见于猪，其他家畜和动物未见发病。不同年龄、品种、性别的猪均可被感染，生长猪和育肥猪感染后症状比较温和，母猪和仔猪的症状则较为严重。PRRS主要经呼吸道感染，也可垂直传播。将感染猪特别是隐性感染猪引入易感猪群是该病流行的重要原因。本病传染性强、传播快，发病率和死亡率高，且在猪群内持续性感染不易清除，多呈散发、点状分布的地方性流行。

1 材料与方法

1.1 发病情况

山东某猪场养的60头仔猪中，其中有30头相继发病，有6头已死亡。发病的仔猪表现为：精神沉郁，咳嗽、打喷嚏；在猪圈内扎堆；食欲减弱，有的甚至废绝，部分猪排灰色稀便；耳朵和嘴尖发绀，行走不稳；并伴有呕吐，体温升高现象。虽采用了抗生素治疗，但效果不明显，造成比较严重的经济损失。

1.2 主要的仪器和试剂

BMJ-1生物组织包埋机，AO-8250型组织切片机，OLYMPUS-BHS显微镜，PCR扩增仪，RT-PCR检测试剂盒。

1.3 病理学检测

1.3.1 大体剖检 对送检的病死仔猪进行了尸体剖检及大体病变的观察。

1.3.2 病理组织学检查 取病变明显的组织(肝脏、肾、心和肺脏)各一小块于10%的福尔马林溶液中进行固定，然后经常规石蜡切片制作、HE染色。在OLYMPUS-BHS显微镜下观察并照相。

1.4 RT-PCR的方法

1.4.1 RT-PCR检测试剂盒组成 变性液(A液)，硫酸钠溶液(B液)，酚/氯仿/异戊醇混合液(C液)，异丙醇(D液)，75%乙醇(E)，处理的灭菌去离子水(F液)，酶抑制剂(G液)，反转录反应液(H液)，反转录酶(I液)，PCR反应液(J 液)，TaqDNA聚合酶(K液)，矿物油(L液)，50倍TAE电泳缓冲液(M液)，溴化乙锭溶液(N液)，上样缓冲液(O液)。

1.4.2 组织样品处理 取待检组织充分研磨，加入PBS(pH7.2)研磨成匀浆，8000r/min 5min，取上清100µl 再加入A液，混匀。取血清100µl，置灭菌离心管中，加入A液，混匀。

1.4.3 病毒RNA的提取 （1）取已处理的样品，每管依次加入B液30µl，C液30µl、C液300µl(颠倒10次，混匀，冰浴15min，4℃12000r/min，离心15min。（2）取300µl上清液，置于经DEPC水处理过的1.5ml灭菌离心管中，加入300µl D液，混匀，置-70℃冰箱中30min。室温融化，4℃，15000 r/min，20min。（3）弃上清，沿管壁缓缓滴入1mlE液，轻轻旋转一周后打掉，将离心管倒扣于吸水纸上1min，氮空抽干16min(以无水乙醇为准)。（4）按9:1比例配制F:G混合液，每个样品用用10µl F:G混合液溶解，﹣20℃储存备用。

1.4.4 反转录(RT)操作 每份总体积20µl 。取16µl H液(用前混匀)、1µl G液、1µl I液、2µl 已溶解的病毒RNA。混匀并做好笔记，在PCR扩增仪上进行以下循环：42℃60min，98℃5min。

1.4.5 PCR操作 每份总体积20µl。取16µl J液(用前混匀)、2µl K液、1µl I液、2µl 1.4.4中的反转录产物。混匀，做好标记并加入L液20µl覆盖，放于PCR扩增仪上，扩增条件为94℃30s，55℃30s，72℃30s。35个循环后，72℃延伸5 min。

1.4.6 电泳 称4g琼脂糖放于500ml锥形瓶中，加入50倍稀释的M液200ml(取4mlM液，用双蒸水稀释至200ml)，于微波炉中溶解，再加入20µl N液混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将PCR扩增物15µl混合3µlO液，点样与琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm电压于50倍稀释的M液中电泳，紫外灯下观察结果。

2 结果

2.1 剖检病变

剖检病死仔猪，主要病变为身体皮肤散在出血点，耳尖发绀；肺脏明显出血，水肿，眼睛有分泌物；胃大弯淤血，小弯淤血；附睾淤血；肠系膜淤血。

2.2 病理组织学变化

肺间质明显增宽，肺间质疏松(图1)。肾小管上皮肿胀，肾小球毛细血管内皮肿胀(图2)。

图1 肺间质明显增宽

图2 肾小管上皮肿胀, 肾小球毛细血管内皮肿胀

2.3 RT-PCR检测结果

被验样品、阳性对照出现400bp扩增带，阴性对照无扩增带出现。

3 讨论

3.1 病例的确诊

通过体表观察到猪耳尖发绀，剖检发现病死仔肺脏明显出血，水肿，符合猪繁殖呼吸障碍综合征的典型症状；组织病理学检测可见肺间质明显增宽，肾小管上皮细胞肿胀；RT-PCR扩增出猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)400bp扩增带。因此综合以上诊断结果表明该猪场发生了猪繁殖呼吸障碍综合征。

3.2 检测技术

PRRS的诊断方法有许多种，病毒的分离鉴定、血清学诊断方法和分子生物学诊断方法等方法及技术。其中，血清学诊断方法有免疫过氧化物酶单层细胞试验(IMPA)、间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELASA)和血清中和试验(SNT)等，但由于PRRSV 的抗原型差异，一种方法只有使用2种抗原亚型才能检出I型、II型的抗原或抗体，因此血清学方法只能用于评价猪群PRRSV感染状况，不能进行确诊。以分子病毒学为基础的单克隆抗体技术、核酸探针杂交技术和RT-PCR技术特异性高、准确且操作简便而被广泛应用(王兰平，2007)，此外还有一些快速的PRRS检测方法，如脂质体免疫测定法(LIA )、高通量疾病基因筛查工具，纳米金标技术等。

3.3 综合防治

本病目前尚无特效药物疗法，主要采取综合防治措施及对症疗法。最根本的方法是消除病猪、带毒猪和彻底消毒，切断传播途径。此外应加强进口猪的检疫和本病的检测，以防本病扩散。因此在这种情况下需要建立有效的管理策略，严格执行消毒制度，实行全进全出制，加强生物安全措施，做好猪群饲养管理，定期对猪群中猪群PRRSV感染情况进行检测，对发病猪场要严密封锁，根据地域情况和猪场特点选择合适的疫苗种类进行免疫接种，增强猪体特异性抗病力(于洪镇，2011)，同时控制好应激及其他疾病的感染。

[1] 郭宝清, 陈章水, 刘文兴等. 从疑似PRRS 流产胎儿分离PRRSV的研究[J]. 中国畜禽传染病, 1996, 87(2): 124.

[2] 林荣泉. 探讨高致病性猪蓝耳病检疫检验与防控[J]. 肉类工业, 2007(9): 38-40.

[3] 王兰平. 猪繁殖于呼吸综合征检测技术综述[J]. 中国动物检疫, 2007, 24(8): 46-47.

[4] 于洪震. 高致病性蓝耳病的发病特点和防治[J]. 山东畜牧兽医, 2011, 32: 26.

[5] Zeman D, Neiger R, Nelson E, et a1. Mine hart M Laboratory investigation of PRRS virus infection in three swine herds. J Vet Diagn Invest.1993, 5(4):52-2528.

（2018–07–02）

S854.4+3

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1007-1733(2019)01-0030-02