不同佐剂制备鸡新城疫、禽流感二联灭活苗免疫效果评价试验

刘晓婧 丛雁方 魏波 王宏华 王艳玲 蒋贻海* 袁延文 张春革 （青岛蔚蓝生物制品有限公司 山东 青岛 青岛动保国家工程技术研究中心有限公司 山东 青岛 青岛蔚蓝生物股份有限公司 山东 青岛 山东省寿光市畜牧兽医管理局 通标标准技术服务有限公司青岛分公司 山东 青岛）



不同佐剂制备鸡新城疫、禽流感二联灭活苗免疫效果评价试验

刘晓婧①丛雁方②魏波②王宏华③王艳玲②③蒋贻海③*袁延文④张春革⑤（①青岛蔚蓝生物制品有限公司 山东 青岛 ②青岛动保国家工程技术研究中心有限公司 山东 青岛 ③青岛蔚蓝生物股份有限公司 山东 青岛 ④山东省寿光市畜牧兽医管理局 ⑤通标标准技术服务有限公司青岛分公司 山东 青岛）

基于对市场现有佐剂产品的了解取不同佐剂产品作比较，以禽类疫苗为例。选取鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活苗(Lasota株+WD株)灭活后抗原液，按不同佐剂的配苗比例分别配制灭活苗，验证其免疫效果。将添加不同佐剂配制的灭活苗分别免疫7日龄商品肉鸡，分6组，每组30只，其中1~5组分别免疫5种不同佐剂配制的禽流感灭活疫苗，6组为空白对照，各免疫0.3ml/只。分别于免疫后14、21、28、35d采血，离心后取血清，利用血凝抑制方法分别检测鸡新城疫和H9亚型禽流感血清抗体。计算抗体平均滴度。试验结果显示，MF59、GEL02和ISA70VG等新型佐剂较传统佐剂均能产生较高的抗体水平且能使机体在短期内快速产生免疫应答反应并能很好的维持其抗体水平。

灭活苗 佐剂 免疫效果

鸡新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一种急性高度接触性传染病，其发病率和死亡率极高[1]。禽流感(AI)则是由A型流感病毒(AIV)引起，主要通过呼吸系统传播的严重侵害禽类呼吸系统和生殖系统的一种传染病[2,3]。在我国新城疫和禽流感等疫病的暴发对养禽业造成了巨大的经济损失，均属于必须要防控的重要疫病。

目前，鸡新城疫和禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(Lasota株+WD株)多数采用白油作为佐剂[4,5]，但随着科技的发展，越来越多的佐剂种类出现，现已提出了许多新的作用机制。选择合适的佐剂可促进机体产生特异的免疫应答反应：提高抗原吸收率、延长抗原储备时间、激活补体活性、促进相关细胞因子释放、将抗原提呈给不同的APC群、调节MHCI型和II型抗原分子表达和刺激抗体产生。为更好地了解不同佐剂制备的鸡新城疫、流感(H9亚型)二联灭活疫苗在鸡群的免疫效果，我们从市场上选取5种禽类疫苗用佐剂，分别配制二联苗，开展了田间鸡新城疫、流感(H9亚型)二联灭活疫苗免疫效果的评估工作。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 肉仔鸡180只。在选定的养殖场根据常规方法养殖。

1.1.2 试验灭活抗原 鸡新城疫病毒(Lasota株)、H9亚型禽流感病毒(WD株)二联灭活抗原液：青岛蔚蓝生物制品有限公司生产。

1.1.3 检测试剂 鸡新城疫HI实验标准抗原和阳性血清均购自中国兽医药品监察所。H9亚型禽流感HI标准抗原和阳性血清均购自哈尔滨维科生物技术开发公司。

1.2 方法

1.2.1 疫苗制备 先将经检测合格的新城疫病毒液和禽流感(H9亚型)灭活病毒液按配苗比例混合，再将混合后的病毒液与佐剂按照其参考剂量制备灭活苗，共制备5种二联灭活苗。

1.2.2 安全检验 根据《中华人民共和国兽药典》附录中的检测方法进行检验。每组疫苗10只，每只颈部皮下注射疫苗0.1ml，观察14日内是否出现因疫苗引起的局部和全身性不良反应[6]。

1.2.3 免疫程序 5种灭活苗分别于肉仔鸡7日龄免疫，剂量0.3ml/羽。不同佐剂制备的二联灭活苗分组情况如表1。

表1 实验分组情况

1.2.4 抗体测定 分别于7日龄免疫前，免疫后14、21、28和35d，每组采集30份鸡血清分别测定其抗体效价。

1.2.5 HI抗体效价测定 按照《中华人民共和国兽药典》附录中血凝抑制标准检测方法[6]，分别测定ND和AI(H9亚型)抗体水平，记录实验结果。

1.2.6 数据整理和分析 对检测结果用Excel、SPSS20.0等软件，进行数据整理、统计分析。HI效价≥4log2判定为合格。

2 结果

2.1 疫苗检验

疫苗检验结果详见表2。由表2可见，各灭活苗的安全检验均符合国家标准。鸡群精神状态良好，采食正常；注射部位未见肉芽组织形成，疫苗吸收良好，机体未产生过敏反应和局部不良反应。

表2 不同佐剂制备的鸡新城疫和禽流感(H9亚型)二联灭活苗安全检验

2.2 抗体检测情况

7日龄肉仔鸡的抗新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的母源HI抗体效价几何平均值分别为6.6log2和7.3log2。免疫后鸡群抗ND和AI的抗体水平详见表3和表4。

表3 实验动物抗新城疫HI滴度测定情况 (nlog2)

注：表中数值均为HI滴度几何平均值。

表4 实验动物抗禽流感H9亚型HI滴度测定情况 (nlog2)

注：表中数值均为HI滴度几何平均值。

2.2 免疫效果监测情况

比较分析鸡群抗新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的HI抗体水平结果，分别见图1、图2。

图1 6组鸡抗新城疫病毒HI抗体滴度变化

（1）由图1可知，鸡群中抗新城疫抗体5组最高，免疫后14d抗体水平均达到合格标准。免疫后28d抗体水平均达到最高值，其中4组和5组效果最好。免疫后35d抗体效价均开始下降但4组较其他疫苗组抗体水平维持期较长，抗体衰减平缓。5组的抗体水平较其他疫苗组在免疫后21d能很快达到较高的抗体水平。1组较其他疫苗组抗体水平明显较低，但仍能达到疫苗保护的国家标准。（2）由图2可知，鸡群中抗H9亚型禽流感病毒的抗体在免疫后14d均能达到合格标准，其中2组和5组在免疫后28d抗体水平达到最高值。免疫后35d各疫苗组抗体水平均有下降，但5组表现出良好的稳定性，鸡群中的抗体水平较其他疫苗组仍维持较高水平。其中，1组仍能达到疫苗的国家标准，但较其他疫苗组抗体水平明显较低。

图2 6组鸡抗H9亚型禽流感病毒HI抗体滴度变化

3 讨论与结论

（1）理想的疫苗应生产成本低、易于运输和保存且易于应用、无毒性反应，能诱导良好的体液免疫，或能诱导良好的细胞介导免疫和黏膜免疫。铝胶和石蜡油佐剂依旧是目前市场应用广泛的免疫佐剂，而灭活疫苗尤其是禽用灭活疫苗，因其抗体滴度维持时间较长，通常使用矿物油佐剂[7,8]。但是，不同佐剂对疫苗免疫效果的增强作用存在差异[9]，市场上有许多新型的佐剂，其便于应用，免疫效果更佳。鸡新城疫、流感二联灭活苗是目前市场广泛应用的禽类疫苗，故我们选取5种佐剂与鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒抗原液按佐剂推荐使用剂量制备出五组二联灭活苗，针对市场上的商品鸡进行免疫效果评价。（2）本研究旨在通过对鸡群免疫后HI抗体的效价来评价目前市场上的多种免疫佐剂的使用效果。试验表明，选取的五种佐剂所制备的二联灭活疫苗均能够刺激机体产生良好的免疫应答反应，抵御病毒攻击，具有较好的免疫保护效果，同时无免疫副反应，疫苗安全有效。（3）本试验发现，7日龄(首免日龄)肉鸡针对新城疫病毒和H9亚型流感病毒的母源抗体效价均较高，免疫后其抗体效价均急剧下降，其原因可能是疫苗抗原与母源抗体中和，因而造成疫苗对鸡群免疫保护的真空期[10]。为尽量减少或避免母源抗体影响，建议定期检测雏鸡母源抗体，根据雏鸡体内母源抗体水平确定首免时间，优化免疫程序。（4）本研究以田间试验方式，对常规养殖的肉鸡180只，按照预定的免疫程序进行免疫，定期采集血清测定抗体效价，评估该疫苗的免疫效果。试验结果显示，第5组添加MF59佐剂的综合表现最好，刺激机体产生抗体较快，免疫后14d即可达到保护水平且最终达到的抗体水平最高，抗体持续时间较长。使用ISA 70 VG佐剂和GEL02佐剂的二联苗免疫效果也很好，使用ISA70VG佐剂虽在免疫后14d抗体水平达不到4log2，但后期刺激机体产生的抗体水平较高持续时间较长；而使用GEL 02佐剂二联苗的鸡群抗新城疫病毒效果较好，抗H9亚型禽流感病毒的HI在免疫后35d下降较快，抗体水平维持时间较短。总体来说，选用的几种佐剂配制的二联苗均能达到免疫保护效果，其中MF59更为突出，即使用纳米粘膜佐剂的疫苗抗体水平维持时间较长。新型佐剂的作用机理和应用效果还需在养殖场进行进一步验证。

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[2]甘孟侯. 禽流感(第2版)[M]. 北京: 中国农业出版社, 2002.

[3] 戚中田. 禽流感病毒与人类禽流感[J]. 中国科学基金, 2004, 2: 68-71.

[4] 王学艳. NDV分离株F及HN基因的遗传变异分析与核酸疫苗质粒的构建[D]. 西北农林科技大学: 西安, 2008.

[5] 李呈军. 中国 H9N2 亚型禽流感病毒进化分析与 H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗的研究[D]. 中国农业科学院: 北京, 2005.

[6] 中国兽药典委员会. 中华人民共和国兽药典[M]. 北京: 中国农业出版社, 2011.

[7] 丛秋实, 胡瑞鸿, 郑德富等. 禽流感(H9)灭活疫苗白油佐剂的优选试验[J]. 中国动物保健, 2013(10): 10-12.

[8] 施建春, 杨惠萍. 不同佐剂的新城疫疫苗免疫效果的研究[J]. 山西农业大学学报(自然科学版), 2014(6): 23-25.

[9] 段龙, 李学钊, 田启会. 常用新城疫疫苗免疫佐剂的筛选[J]. 中国家禽, 2015, 37(14): 65-66.

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（2018–09–18）

青岛“人才特区”人才项目, 新型禽流感纳米黏膜佐剂疫苗的开发

S851.3

A

1007-1733(2019)01-0008-03