信鸽粪便样品中四种常见病原的检测与分析

王乐 蒋智宇 朱建国 张孟涛 余磊 孙淑红* （齐鲁动物保健品有限公司 山东 济南 250100 山东农业大学 山东 泰安）



信鸽粪便样品中四种常见病原的检测与分析

王乐①†蒋智宇②†朱建国②张孟涛②余磊②孙淑红②*（①齐鲁动物保健品有限公司 山东 济南 250100 ②山东农业大学 山东 泰安）

为评估某大型信鸽饲养场信鸽的健康风险，本研究对新城疫病毒(NDV)、H9流感病毒(AIV-H9)、沙门氏菌和大肠杆菌等四种信鸽常发病原进行了检测，并对其常用敏感药物的使用现状评估。从样本总量为15000只左右的某信鸽群随机采集56份新鲜粪样，对沙门氏菌、大肠杆菌进行分离鉴定，取4份用K-B法检测常用药物耐药情况；随机取24份粪便样品分别提取RNA，用针对NDVHN和F基因2对引物、AIV-H9的1对引物分别进行RT-PCR检测NDV和AIV携带情况。结果表明，NDV和AIV-H9的RT-PCR检测结果显示均为阴性(0/24、0/24)；沙门氏菌检测为阴性(0/56)，大肠杆菌检测阳性率为71.42%(40/56)；4份大肠杆菌阳性的粪样药敏试验结果显示为头孢西丁、头孢他啶敏感，本研究对该信鸽群的养殖健康以及合理用药等方面有一定的指导意义。

信鸽大肠杆菌 沙门氏菌新城疫病毒(NDV) H9流感病毒(AIV-H9)

信鸽也称“通信鸽”，经由普通鸽子驯化，然后提取其优越性能并加以利用和培育而产生。人们利用信鸽天生的归巢本能，可用来传递紧要信息；现在信鸽的主要用途是比赛，即称为“赛鸽”，由于赛鸽具有一定的可观赏性以及在比赛过程中可以获得经济效益，近些年出现了许多赛鸽养殖场，用于培育、饲养、训练赛鸽，以求得在比赛过程中获得优异成绩，并选育出可用于繁殖后代的优质种鸽。显然，健康优秀的信鸽是比赛获得名次的必要条件，本研究拟通过对信鸽粪便样品中的四种常见病原的检测[1]以及对常用药物敏感试验的测定，初步评估该信鸽群健康风险[2]，并为养殖信鸽过程中的抗生素使用提供参考。该研究对信鸽养殖业的健康发展具有一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 某规模化信鸽场，存养15000羽信鸽，用无RNA酶的离心管采集56份新鲜粪便样品。

1.1.2 试验材料 质控大肠杆菌(菌株编号为ATCC25922)，肠炎沙门菌(菌株编号CVCC3377)由山东农业大学家禽疫病防控研究室保存；沙门菌显色培养基(上海欣中生物工程有限公司)；亚硒酸盐胱氨酸增菌液(北京陆桥技术股份有限公司)；RNA isolater(Vazyme Bio)；50×TAE buffer：242gTris，57.1ml冰醋酸、100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，加双蒸水定容至1000ml，工作浓度为1×TAE；TAE缓冲液：取20ml50×TAE，加水定容至1000ml；DL2000DNA Maker(宝生物(大连)有限公司)；LB培养基：细菌培养用胰化蛋白胨10g(Bacto-teyptone)(OXOID公司)、细菌培养用酵母提取物5g(Bacto-yeast extract)(OXOID公司)、NaCl 10g，琼脂粉(Solarbio)15g，1000ml去离水；缓冲蛋白胨水(青岛高科园海博生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 用灭菌棉签挑取信鸽新鲜粪便样品(每5只信鸽的粪样作为一个样本)，放入无RNA酶的2ml离心管中，用含有冰袋的泡沫盒6h内运回实验室。

1.2.2 样品的处理和保存 每份粪便样品分为两部分，其一加入适量RNase-free水稀释，用于RNA提取；其二用于沙门菌和大肠杆菌的分离鉴定。56份(编号1~56)粪便样品分别用于沙门菌和大肠杆菌分离鉴定以及药敏试验；随机取24份(编号1~24)加入少许RNase-free水，震荡混匀后先-20℃环境放置30min，然后转移到-80℃保存，提取RNA，然后用于NDV、AIV的RT-PCR检测。

1.2.3 样品中沙门氏菌、大肠杆菌的分离鉴定 本方法以GB 4789.4-2016国标为基础，经本实验室改进后对沙门氏菌、大肠杆菌进行分离鉴定，并用PCR方法重复检测2次，保证在检测过程的准确性和灵敏性。其中，显色培养基使用说明可知，大肠杆菌在平板上表现为蓝色，沙门氏菌变现为紫色。可疑菌落的PCR验证：根据GenBank公布的沙门氏菌、大肠杆菌保守区域的基因序列，用Primer5.0软件设计引物FimW、E-jiand。引物由上海生物工程技术有限公司合成(见表1)；PCR阳性的菌落再次划板纯化培养20~24h，然后再次挑取可疑菌落进行PCR重复验证。

琼脂凝胶糖电泳：吸取5μl保存的PCR产物，注入1%琼脂糖凝胶，以120V电压进行电泳检测，并加入DNA分子量标志(DNA maker)以辅助判读DNA样品。50min电泳结束后，如大肠杆菌E-jiand引物所合成的目的基因在622bp左右，则视为大肠杆菌阳性；如沙门氏菌FimW引物所合成的目的基因在495bp左右，则视为沙门氏菌阳性。

表1 沙门菌FimW和大肠杆菌E-jiand鉴定引物信息

①将紫色可疑菌落用沙门氏菌FimW引物进行PCR验证，将蓝色可疑菌落用大肠杆菌E-jiand-F/R引物进行PCR验证；②FimW引物检测沙门菌的程序和体系：体系共25μl，其中2×PCR Master Mix12.5μl、以可疑菌落为模板(忽略不计)、上下游引物(10pmol/μl)各0.5μl、ddH2O 11.5μl；程序94℃ 4min(预变性)，94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1min，共25个循环， 72℃ 10min(延伸)，4℃结束；③E-jiand-F/R引物检测大肠杆菌的程序和体系：体系共25μl，其中2×PCR Master Mix12.5μl、以可疑菌落为模板(忽略不计)、上下游引物(10pmol/μl)各0.5μl、ddH2O 11.5μl；程序94℃预变性7min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min，4℃结束。

1.2.4 大肠杆菌阳性阳性的药物敏感试验 使用K-B法检测9种常用抗菌药物的敏感性。抗菌药物包括：诺氟沙星、红霉素、链霉素、环丙沙星、氯霉素、头孢西丁、头孢他啶、庆大霉素、多粘菌素B等。

1.2.5 检测粪便 样品中NDV、AIV-H9的RT-PCR检测粪便样品总RNA提取及总RNA浓度的测定及质量检测：采用试剂盒分别提取样品总RNA，用Nanodrop ND-1000测定RNA样品质量和浓度，记录OD260/OD280，OD260 /OD230的值，两个值均在1.8~2.0范围内，表明提取的RNA纯度较高。反转录：本研究参照Roche反转录试剂盒操作进行，用20μl体系，最终将RNA反转录为cDNA，并-20℃保存。具体操作方法见表2。

表2 反转录体系 (μl)

RT-PCR检测粪便样品中NDV、AIV-H9：引物设计根据GenBank公布的NDV保守区域的基因序列，用Primer5.0软件设计引物NDV(HN-S、HN-F)与AIV-H9保守区域的基因序列，用Primer5.0软件设计引物AIV-H9，由上海生物工程技术有限公司合成(见下表3)。

表3 NDV(HN-S、HN-F)、AIV-H9引物相关信息

③HN-S/ HN-F引物检测NDV的程序和体系：体系共25μl，其中2×PCR Master Mix12.5μl、cDNA模板1μl、上下游引物(10pmol/μl)各0.5μl、ddH2O 10.5μl；程序94℃ 5min(预变性)，94℃ 1min，54℃ 1min，72℃ 2min，共30个循环，72℃ 10min(延伸)，4℃结束；④AIV-H9引物检测流感病毒的程序和体系：体系共25μl，其中2×PCR Master Mix12.5μl、cDNA模板1μl、上下游引物(10pmol/μl)各0.5μl、ddH2O 11.5μl；程序94℃预变性5min，94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环，72℃延伸10min，4℃结束。

琼脂凝胶糖电泳：同1.2.3。

2 结果

2.1 信鸽粪样中四种常见病原检测结果

从56份粪便样品中检测到40份大肠杆菌阳性率为71.43%(40/56)，见表4、图1；沙门氏菌检测为阴性(0/56)，见表4、图2。检测的24份cDNA中NDV检测为阴性，阳性对照成立(1776bp左右的特异性条带，图3)；检测的24份cDNA中AIV-H9检测为阴性，阳性对照成立(850bp左右的特异性条带，图4)。

表4 四种常见病原的检测结果

图1 部分大肠杆菌的PCR结果琼脂凝胶电泳图

图2 部分沙门氏菌的PCR结果琼脂凝胶电泳图

图3 部分样品NDV(NH-S)的PCR结果琼脂凝胶电泳图

图4 部分样品AIV-H9PCR结果琼脂凝胶电泳图

2.2 药敏试验检测结果

随机取4份大肠杆菌阳性样品(编号38、42、24、53)，做常用药物的药敏试验。结果表明：4份样品均对头孢西丁、头孢他啶敏感，对诺氟沙星、红霉素、链霉素、环丙沙星、氯霉素、庆大霉素表现为耐药，对多粘菌素B表现为部分耐药(见表5)。

表5 4份细菌阳性样品的药敏直径 （mm）

3 讨论

（1）鸽新城疫与沙门氏菌的混合感染[3]、鸽NDV与AIV-H9的混合感染[4]、致病性大肠杆菌和沙门氏菌引起鸽肠炎的报道[5]近年来屡次报道。显然，常见病原的污染以及不合理滥用抗生素，已经成为影响信鸽健康养殖的潜在风险。随着信鸽饲养业不断兴起，人们对信鸽的健康养殖越来越关注。（2）本研究结果显示，24份抽检粪便样品中NDV与AIV-H9均为阴性，而我们在前期普查中发现该鸽群新城疫抗体均匀度较好(平均6~8log2)，该检测结果在一定程度上反映出该信鸽场对常见病毒病的防控效果较好。56份粪便样品未检出沙门菌，大肠杆菌阳性检出率为71.43(40/56)，但检测出来的大肠杆菌是否对信鸽具有致病性仍需要后续实验加以探究。药敏试验显示为头孢西丁、头孢他啶对粪便中细菌敏感，对诺氟沙星、红霉素、链霉素、环丙沙星、氯霉素、庆大霉素表现为耐药，对多粘菌素B表现为部分耐药。结果表明，该鸽群细菌耐药情况严重，应采取合理用药、寻找抗生素的有效替代品等措施来减少耐药细菌的产生。（3）本研究以该大型信鸽饲养场的新鲜粪便样品为实验材料，完成了信鸽四种常见病原的检测及其耐药情况测定，该研究对该信鸽群的健康养殖的初步评估及其合理选择使用抗生素，减少耐药菌群的出现等方面有一定的指导意义。本批次信鸽粪便样品中未检测出NDV、AIV-H9以及沙门氏菌，但更完整全面了解该信鸽群常见病原污染情况，仍需要周期性地采样检测病原，并结合血清抗体结果以及临床症状等进一步评估。

[1] 李治, 范俊清等. 信鸽新城疫病毒的分离、鉴定及F基因的进化分析[J]. 中国家禽, 2018, 40(8): 56-59.

[2] 李建国, 覃杰等. 信鸽新城疫的防治[J]. 畜禽业, 2018, 29(8): 138-140.

[3] 杨平, 刘永恒, 张军等. 一例信鸽新城疫与沙门氏菌混合感染的诊断与治疗[J]. 家禽科学, 2015(9): 36-37.

[4] 徐技松, 张军, 刘永恒. 1例信鸽新城疫的诊断与治疗[J]. 养禽与禽病防治, 2016(9): 37-38.

[5] 赵兰斌. 鸽子的沙门氏菌病的诊断治疗[J]. 中国畜牧兽医文摘, 2018, 34(5) :210-219.

（2018–08–10）

†共同第一作者；

S852.61

A

1007-1733(2019)01-0001-03